Sviluppo e validazione di un metodo cromatografico in HPLC per il dosaggio della vitamina K nel plasma

Per vitamina K si intende una serie di composti tra cui i fillochinoni o vitamina K1 (sintetizzati dalle piante verdi, la forma prevalente nella dieta) e i menachinoni o vitamina K2, sintetizzati dai batteri. Nell¿uomo, la vitamina K è il cofattore di un enzima che catalizza la carbossilazione di specifici residui di acido glutammico nelle principali proteine coinvolte nel processo di coagulazione e nella osteocalcina, favorendo cosi¿ la loro attivazione. Carenza di vitamina K e¿ stata riscontrata sia in pazienti con sindromi emorragiche che affetti da osteoporosi. La quantificazione delle diverse forme di vitamina K con adeguati metodi analitici rappresenta ancora una sfida non indifferente a causa dei bassi livelli plasmatici (0.25-2.7 nmol/L) rispetto agli altri lipidi presenti. Cio¿ e¿ dimostrato dalla mancanza di un ¿metodo di riferimento¿ ufficiale, dalla esiguita¿ dei centri impegnati in questa analisi, e dalla assenza di studi specifici sull¿assunzione di vitamina K in Italia. Inoltre, i livelli di riferimento dell¿assetto vitaminico di una popolazione sono fortemente dipendenti dalle abitudini dietetiche del Paese stesso, ed e¿ quindi mandatario prima di intraprendere qualunque ricerca a questo riguardo, la individuazione di questi valori sulla nostra popolazione sana. Obiettivo della ricerca e' sviluppare un metodo per il dosaggio della vitamina K nel plasma mediante HPLC con derivatizzazione post-colonna e rivelazione fluorimetrica. Lo sviluppo del metodo, basato sulla letteratura esistente, dovra¿ presentare caratteristiche innovative in termini di sensibilita¿ e rapidita¿ di analisi allo scopo di permetterne la applicazione su una ampia casistica di campioni anche di provenienza neonatale o pediatrica, spesso a rischio di malassorbimento e malnutrizione. La ricerca si sviluppera¿ su due aspetti: ottimizzazione della fase pre-analitica e ottimizzazione della fase analitica. Dapprima si testeranno due procedure analitiche alternative: una basata sulla estrazione dei lipidi totali dal plasma e sulla seguente purificazione della vitamina K dall¿ estratto, l¿altra basata sulla purificazione dei composti idrosolubili mediante estrazione in fase solida e sulla successiva estrazione della vitamina K. La fase analitica verra¿ ottimizzata testando due diverse colonne per HPLC: una a base silicea e una a base polimerica di nuova generazione. Il metodo dovra¿ poi essere validato per quanto riguarda le performances analitiche ed in particolare la accuratezza verra¿confermata per confronto i valori di consenso assegnati a campioni provenienti da Programmi di Controllo Qualita¿ a livello Europeo. Risultati previsti: creare un centro specializzato per questo tipo di analisi che permetta di definire valori di riferimento per la vitamina K a livello italiano. Sviluppare, in collaborazione con altri gruppi della nostra Universita¿, protocolli di ricerca sulle disvitaminosi in diverse situazioni cliniche.