Caratterizzazione fenotipica di un topo Knock-Out per il gene del canale pacemaker cardiaco HCN4
Progetto BACKGROUND. I geni HCN (Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide-gated channel) sono i correlati molecolari dei canali pacemaker; selettivamente espressi nel tessuto di conduzione cardiaco ed in particolare a livello del nodo senoatriale. I canali pacemaker permettono il passaggio di una corrente depolarizzante (If) la cui funzione consiste nell¿indurre la depolarizzazione diastolica lenta, o fase pacemaker, che è la causa dell¿autoritmicità delle cellule senoatriali. Tale corrente e¿ attivata durante la ripolarizzazione cellulare e modulata dall¿ interazione diretta con il secondo messaggero cAMP. Questo secondo messaggero rappresenta il punto di convergenza della modulazione autonomica cardiaca. In particolare la stimolazione colinergica determina una riduzione del cAMP con conseguente diminuzione dell¿ampiezza della corrente If e della frequenza cardiaca, mentre la stimolazione ß-adrenergica induce un aumento del cAMP con conseguente aumento della frequenza cardiaca indotta dall¿aumento della corrente If. Il gruppo del Prof. Di Francesco (Dipartimento di Fisiologia, Facolta¿ di Biologia, Universita¿ di Milano) ha generato una linea di topi in cui il gene HCN4 può venire eliminato in modo condizionale ed inducibile.
Precedenti esperimenti su topi knock-out non inducibili (cioè mancanti del gene HCN4 cardiaco fin dalle primissime fasi embrionali) hanno dimostrato che il processo di sviluppo embrionale procede normalmente fino al 10° giorno e poi si arresta per mancata formazione del cuore, ma nulla hanno potuto dire sul ruolo di HCN4 nell¿animale adulto. Con il presente progetto di ricerca intendiamo verificare nell¿topo adulto gli effetti fenotipici derivanti dall¿eliminazione completa di entrambi gli alleli HCN4; a livello del ritmo cardiaco e della sua modulazione autonomica.
METODI. Verranno utilizzati 10 topi knock-out inducibili per il gene HCN4 e 10 controlli wild type. Il processo di knock-out verrà indotto alla sesta settimana di vita e gli effetti sensibili della mutazione dovrebbero manifestarsi dopo circa una settimana dall¿inizio del trattamento con estrogeno. L¿acquisizione del segnale elettrocardiografico verra¿ effettuata mediante telemetria (Data Science). Le registrazioni verranno eseguite girornalmente sia prima che dopo trattamento con estrogeno e i dati saranno paragonati mediante tests statistici adeguati. Il protocollo terminera¿ all¿ ottava settimana dall¿inizio della somministrazione di Tamoxifene. I dati acquisiti verranno quindi analizzati utilizzando tecniche di analisi spettrali che consentiranno di valutare l¿ andamento della variabilita¿ della frequenza cardiaca e la bilancia simpatovagale prima e dopo lo ¿spegnimento¿ del gene.
OBIETTIVO. L¿ obiettivo di questo progetto di ricerca e¿ quello di approfondire le conoscenze sui meccanismi elettrofisiologici che sono alla base della genesi genetico-molecolare del ritmo cardiaco e della sua variabilita¿.