Ottimizzazione del canale ionico dimerico concatenato HCN1-HCN4 per la generazione di un pacemaker biologico
Progetto Obiettivo generale: generare diversi costrutti adenovirali dimerici HCN1-4 con proprietà cinetiche adatte ad indurre potenziali d’azione spontanei e regolari in colture primarie di miociti ventricolari neonatali. Questo rappresenta un passaggio necessario in vitro in vista di una successiva applicazione in vivo su modelli animali e del fine ultimo che prevede lo sviluppo di un pacemaker biologico per applicazioni cliniche.
Obiettivi specifici: 1) Fornire una analisi dettagliata delle proprietà funzionali (cinetica e modulazione) del canale tandem HCN1-4 espresso in cellule HEK 293 ed in colture di miociti cardiaci. 2) Generare mutazioni nel costrutto in aminoacidi importanti nel determinare le proprietà cinetiche del canale e verificare, sempre in un sistema di espressione eterologa, se il canale mutato riproduce fedelmene le proprietà di voltaggio dipendenza del canale pacemaker nativo. 3) Esprimere il/i costrutto/i HCN1-4 mutato/i, in miociti ventricolari per verificarne le proprietà funzionali in un contesto cellulare cardiaco. 4) Assemblare il costrutto o i costrutti che meglio riproducono le proprietà del canale pacemaker nativo in adenovirus funzionanti e purificare gli adenovirus.