L’autofagia è un processo dinamico che prevede il sequestro di porzioni di citoplasma in vescicole delimitate da una doppia membrana; dopo fusione con i lisosomi, il materiale sequestrato è degradato e i prodotti riciclati. Il processo è cruciale nel controllo del turn-over di proteine e organuli cellulari e nella sopravvivenza cellulare in condizioni di stress; in differenti condizioni può anche essere effettore di morte cellulare programmata. Il meccanismo autofagico può essere stimolato da differenti condizioni come la riduzione di nutrienti, lo stress ossidativo e il trattamento con xenobiotici; è inoltre associato a numerosi processi fisio-patologici quali differenziamento, sviluppo, malattie neurodegenerative e cancro. Studi recenti indicano l’importanza dell’autofagia anche nei tumori gliali, nonostante i meccanismi molecolari che regolano la sua attivazione e mediano i relativi effetti (protettivo o citotossico) siano in gran parte poco noti.
Questa ricerca si propone di indagare il ruolo della sfingomielinasi acida (SMasi-A) nella modulazione dei livelli di ceramide, nell’induzione di autofagia e nel destino di cellule da glioma umano. La SMasi-A, enzima che idrolizza la sfingomielina a ceramide e fosforilcolina, è un componente cruciale delle vie di trasduzione del segnale sfingolipide-mediate attivate in condizioni di stress cellulare. Sebbene questo enzima sia in sede endo/lisosomale, differenti stimoli inducono la sua traslocazione alla membrana plasmatica ed attivazione. In recenti esperimenti abbiamo evidenziato che in cellule da glioma il ceramide induce autofagia, e che l’attività della SMasi-A è ridotta in cellule resistenti a stimoli autofagici citotossici. In questa ricerca utilizzeremo colture di cellule da glioma in differenti condizioni di attivazione dell’autofagia, quali la rimozione di siero, differente confluenza cellulare, trattamenti con agenti alchilanti e con ceramide. L’entità dell’autofagia sarà monitorata in microscopia a fluorescenza dopo colorazione con Arancio di Acridina e analizzando la formazione della proteina LC3B-II, marker specifico del processo. In parallelo studieremo la localizzazione, l’attivazione e l’espressione della SMasi-A, mediante esperimenti di immunolocalizzazione, pulse/chase con sfingomielina triziata, dosaggi in vitro dell’attività enzimatica e real time PCR. Nelle stesse cellule valuteremo anche i livelli e la composizione molecolare di ceramide e sfingomielina (mediante spettrometria di massa) e lo stato di attivazione di vie di trasduzione del segnale coinvolte nel controllo dell’autofagia e del destino cellulare (P I3-K,Beclin-1, Akt/PKB, Erk e JNK). Verrà infine studiato l’effetto dell’inibizione della SMasi-A (somministrazione di inibitori specifici, siRNA) su autofagia e vitalità cellulare. Complessivamente, questa ricerca potrà fornire un contributo alla comprensione dei meccanismi biochimici che controllano sopravvivenza e morte cellulare programmata.