Ruolo dello splicing nel regolare l'attività epigenetica di Lysine Specific Demethylase 1, LSD1, nel sistema nervoso.
Progetto Nel sistena nervoso l’epigenetica svolge un ruolo chiave nel permettere l’integrazione di molteplici segnali cruciali per la maturazione ed il commitment cellulare terminale oltre che la plasticità neuronale (Walton et al., 1999; Tartaglia et al., 2001; Borrelli et al., 2008). LSD1 Lysine Specific Demethylase 1 (LSD1) è la prima istone demetilasi identificata (Forneris et al., 2005a; Shi et al., 2004) la cui attività è stata associata alla repressione trascrizionale coinvolta nel controllo di diversi procesi biologici tra cui lo sviluppo, il differenziamento ed alcuni tumori. Recentemente LSD1 è stata anche coinvolta in disordini neurologici ma il suo ruolo nel sistema nervoso è ad oggi del tutto ignoto. La nostra ricerca ha lo scopo di identificare il significato funzionale delle quattro isoforme di splicing di LSD1 che sono generate dalla inclusione mediante splicing di due nuovi esoni. Uno studio dell’espressione in diversi tessuti umani ha rivelato che due di queste isoforme sono neuro-specifiche. Lo splicing è un importante fonte di diversità proteomica. In effetti è possibile che l’acquisizione di uno dei due esoni modifichi il sito attivo di LSD1, e che quindi lo splicing possa contribuire ad una regolazione fine dell’attività enzimatica nel cervello. Su queste basi, caratterizzeremo le proprietà conferite dall’inclusione dei due esoni alternativi nella proteina LSD1 “convenzionale”. Per prima cosa esprimeremo in E. coli e purificheremo le varianti di splicing che verranno utilizzati per studi biochimico e strutturali.
Le varianti verranno da noi saggiate per la loro capacità di funzionare com co-repressori usando un saggio di gene reporter. Verrà anche saggiata la loro capacità di formare complessi stabili con altri partner proteici noti. Verrà poi analizzato il profilo di espressione dei diversi trascritti di LSD1 e delle relative isoforme proteiche durante lo sviluppo del topo in particolare del sistema nervoso. Per misurare in maniera quantitativa il livello dei diversi trascritti useremo una tecnica recentemente da noi sviluppata basata sulla PCR, che permette di quantificare i singoli eventi di splicing. Verranno generati anticorpi isoforma-specifici per analizzare diverse aree del cervello e differenti stadi di sviluppo. Inoltre verrà prodotto un topo mutante privo dell’esone neurospecifico ma che però mantiene l’espressione della LSD1 ubiquitaria. Questo verrà fatto in collaborazione con la Telethon Research core facilities. Di tale mutante verrà studiato in dettaglio il fenotipo. Questi diversi approcci nel loro insieme aumenteranno la nostra comprensione del ruolo di LSD1 nel controllare l’espressione genica e l’identità cellulare nel sistema nervoso. Una maggiore conoscenza dello splicing alternativo nel regolare la funzione di LSD1 in particolare nel cervello, potrà allargare il potenziale impatto dei nuovi inibitori di LSD1 nelle terapie antitumorali e in quelle neurologiche.