Negli eucarioti la trascrizione dei geni è un processo altamente regolato, in cui il legame al DNA della RNApol-II è controllato dai fattori di trascrizione generali che permettono la formazione del complesso di preinizio sul promotore minimo. Inoltre, fattori trascrizionali specifici legano elementi conservati nelle regioni attivatrici, regolando sia l’accesso alla cromatina che l’attività del complesso. Fra essi NF-Y agisce sinergisticamente con altri fattori di trascrizione per regolare l’attività dei promotori attraverso il riconoscimento ed il legame del motivo di DNA noto come CCAAT box, presente in circa il 30% dei promotori.
Strutturalmente NF-Y è un eterotrimero composto dalle subunità NF-YA, YB e YC, ciascuna contenente una regione “core” evolutivamente conservata che è sufficiente per garantire le interazioni che stabilizzano il complesso. La dimerizzazione di YB e YC è necessaria per l’interazione con YA, che permette il legame del motivo CCAAT e induce un piegamento/distorsione del DNA, evento chiave per le sue conseguenze sulla trascrizione.
La ricerca PUR qui presentata propone la espressione, purificazione, cristallizzazione e determinazione della struttura 3D del complesso quaternario delle regioni core di NF-YA, YB e YC con un oligonucleotide di DNA contenente il CCAAT box (NF-Y/DNA). Tale studio è di particolare rilevanza poiché da un punto di vista strutturale finora è stato solo caratterizzato il complesso dimerico fra i core YB-YC, che ha mostrato come la loro interazione sia analoga al complesso istonico H2A/H2B, ma non ha dato informazioni su come NF-Y leghi il CCAAT box e pieghi il DNA, essendo tale interazione mediata principalmente da YA.
Per la purificazione del complesso trimerico NF-Y sfrutteremo un sistema di coespressione che permette di produrre in batteri le diverse proteine solubili. La presenza di una His-tag sulla subunità YA permetterà di copurificare, utilizzando colonne al nichel, il dimero YB-YC associato a YA. Una prima gel filtrazione (GF) separerà il trimero dalla subunità YA libera. Il trimero sarà poi associato a un oligo a doppio filamento contenente la sequenza CCAAT. Con una seconda GF isoleremo il complesso quaternario da proteine e DNA liberi. Per la formazione del complesso NF-Y/DNA testeremo DNA di diversa lunghezza ed estremità, disegnati sulla sequenza promotore di Hsp70, target ad alta affinità di NF-Y.
Gli esperimenti di cristallizzazione su NF-Y/DNA saranno effettuati con un sistema robotizzato, utilizzando gocce proteiche di volume <200 nL. Le prove comprenderanno circa 1000 differenti condizioni di crescita cristallina. Una volta identificate le condizioni di cristallizzazione, esse saranno ottimizzate, prima di eseguire gli esperimenti di diffrazione di raggi X presso il sincrotrone ESRF di Grenoble. La struttura di NF-Y/DNA verrà determinata col metodo delle Sostituzioni Molecolari utilizzando come modello la struttura del dimero YB-YC e raffinata alla risoluzione massima ottenuta.