STUDIO DEL RUOLO DELLA N-GLICOSILAZIONE NELLA ATTIVITA' E STABILITA' DELLA CICLOOSSIGENASI-2 IN CELLULE ENDOTELIALI UMANE
ProgettoPremessa:
Studi precedentemente condotti, hanno evidenziato un ruolo chiave dell'enzima cicloosigenasi-2 (COX-2) non solo nell'ambito di condizioni patologiche che riconoscono una base di tipo infiammatorio o nelle neoplasie, ma anche nella omeostasi a livello vascolare e, da ultimo, negli eventi di riparazione. L a COX-2 è una proteina la cui struttura presenta 5 potenziali siti di glicosilazione. Tuttavia il ruolo di questa modificazione co- e post-traslazionale nei confronti dell'attività dell'enzima, presenta ancora lati oscuri.
Obiettivo:
Sulla base di queste premesse, la ricerca che qui proponiamo ha lo scopo di valutare il ruolo dello stato di glicosilazione sull'espressione, attività ed emivita della COX-2 in cellule endoteliali umane isolate dal cordone ombelicale (HUVEC). A tale scopo verranno utilizzati approcci sperimentali diversi, sia impiegando agenti che causano deglicosilazione completa della proteina (tunicamicina, endoglicosidasi H), sia agenti in grado di provocare uno stato di ipoglicosilazione. Infatti, sulla base di esperimenti condotti da questo gruppo di ricerca (Eligini et al. Br J Pharmacol, 2000) è stata evidenziata la capacità peculiare del perossinitrito, non condivisa da altri donatori di monossido d'azoto, di indurre, nelle HUVEC, espressione di una COX-2 che presenta la caratteristica di essere ipoglicosilata. Gli esperimenti verranno condotti impiegando sia lisati cellulari sia la proteina isolata in seguito ad immunoprecipitazione. La fase successiva della ricerca prevede la valutazione degli effetti dello stato di glicosilazione nei confronti dell'attività enzimatica e dell'emivita della COX-2. E' infatti possibile che l'alterato stato di glicosilazione non permetta un "folding" ed una stabilizzazione appropriati della proteina e che, su tale base, ambedue questi aspetti.vengano influenzati, come già dimostrato per altre proteine.
Studi precedentemente condotti, hanno evidenziato un ruolo chiave dell'enzima cicloosigenasi-2 (COX-2) non solo nell'ambito di condizioni patologiche che riconoscono una base di tipo infiammatorio o nelle neoplasie, ma anche nella omeostasi a livello vascolare e, da ultimo, negli eventi di riparazione. L a COX-2 è una proteina la cui struttura presenta 5 potenziali siti di glicosilazione. Tuttavia il ruolo di questa modificazione co- e post-traslazionale nei confronti dell'attività dell'enzima, presenta ancora lati oscuri.
Obiettivo:
Sulla base di queste premesse, la ricerca che qui proponiamo ha lo scopo di valutare il ruolo dello stato di glicosilazione sull'espressione, attività ed emivita della COX-2 in cellule endoteliali umane isolate dal cordone ombelicale (HUVEC). A tale scopo verranno utilizzati approcci sperimentali diversi, sia impiegando agenti che causano deglicosilazione completa della proteina (tunicamicina, endoglicosidasi H), sia agenti in grado di provocare uno stato di ipoglicosilazione. Infatti, sulla base di esperimenti condotti da questo gruppo di ricerca (Eligini et al. Br J Pharmacol, 2000) è stata evidenziata la capacità peculiare del perossinitrito, non condivisa da altri donatori di monossido d'azoto, di indurre, nelle HUVEC, espressione di una COX-2 che presenta la caratteristica di essere ipoglicosilata. Gli esperimenti verranno condotti impiegando sia lisati cellulari sia la proteina isolata in seguito ad immunoprecipitazione. La fase successiva della ricerca prevede la valutazione degli effetti dello stato di glicosilazione nei confronti dell'attività enzimatica e dell'emivita della COX-2. E' infatti possibile che l'alterato stato di glicosilazione non permetta un "folding" ed una stabilizzazione appropriati della proteina e che, su tale base, ambedue questi aspetti.vengano influenzati, come già dimostrato per altre proteine.