TIPIZZAZIONE DI CEPPI CLINICI DI CRYPTOCOCCUS NEFORMANS E CRYPTOCOCCUS GATTII ISOLATI IN ITALIA ED IN INDIA

Cryptococcus neoformans e C.gattii sono due specie di lieviti capsulati in grado di causare meningoencefalite in pazienti sia immunocompromessi, per lo più HIV positivi, che immunocompetenti. C.neoformans è una specie ubiquitaria e viene distinta in due varietà: var.neoformans che include tutti gli stipiti di sierotipo D e var.grubii che include quelli di sierotipo A. A quest'ultima appartiene la maggior parte degli isolamenti clinici e ambientali. C.gattii è invece una specie isolata prevalentemente nelle regioni subtropicali, anche se recentemente un'epidemia causata da questa specie è stata registrata in Canada. Nell'ambito di due distinti studi epidemiologici sulla criptococcosi condotti in Italia (129 casi) e in India (156 casi) sono stati raccolti i ceppi responsabili di infezione. I due Paesi sono diversi dal punto di vista geografico e socio-economico, e anche per quanto riguarda l'epidemiologia di questa micosi: in Italia l'introduzione e l'accessibilità per tutti i pazienti a terapie antiretrovirali (HAART) ha contribuito alla riduzione anche dei casi di criptococcosi, al contrario in India l'accessibilità all¿HAART è ancora ristretta ad un ridotto numero di pazienti e i casi di criptococcosi sono in continuo aumento. Scopo del progetto è confrontare i dati microbiologici (specie, sierotipo, mating type, genotipo, sensibilità agli antifungini, potenziale patogeno) dei ceppi isolati nelle due differenti aree geografiche e di correlarli con i dati demografici, epidemiologici e clinici derivati dagli studi epidemiologici. Il progetto è articolato in 3 fasi. La prima si pone l'obiettivo di tipizzare tutti i 290 ceppi disponibili mediante sierotipizzazione, identificazione del mating type (a o alfa) mediante multiplex PCR di 4 geni contenuti nel locus del mating type, genotipizzazione mediante PCR-fingerprinting utilizzando due diversi primer, M13 e (GACA)4, e genotipizzazione mediante sequenziamento di 7 geni ipervariabili: GDP1, IGS1, LAC1, CAP59, URA5, PLB1 e SOD1. La seconda fase prevede lo studio della sensibilità in vitro a 5 antifungini (voriconazolo, fluconazolo, itraconazolo, amfotericina B, 5-fluorocitosina) mediante la metodica standard della microdiluizione in brodo. Verranno analizzate sia la minima concentrazione inibente che la minima concentrazione fungicida. La terza fase prevede di saggiare alcuni fattori di virulenza quali la produzione di melanina e di fosfolipasi, la sensibilità alla temperatura e ai raggi UV e la dimensione della capsula. In parallelo si condurranno studi di virulenza in vivo con i ceppi appartenenti ai differenti genotipi osservati, inoculando i lieviti per via i.v. in un modello sperimentale murino. Verranno studiate la sopravvivenza a 30 giorni e la quantità di lieviti presenti nel cervello dopo 15 giorni dall'inoculo. L'analisi finale confronterà i dati microbiologici dei ceppi isolati nelle due differenti aree geografiche correlandoli con i dati epidemiologico-clinici.