CORRELAZIONE GENOTIPO-FENOTIPO NELLA SINDROME DA MICRODELEZIONE NF1: RICERCA DI GENI CANDIDATI PER IL RITARDO MENTALE E LE MALFORMAZIONI CARDIACHE
Progetto La sindrome da microdelezione NF1 è dovuta alla mancanza di una copia del gene NF1 e geni fiancheggianti. Abbiamo precedentemente rilevato un'incidenza significativamente superiore di ritardo mentale (RM) e anomalie cardiovascolari (AC) nei pazienti (pz) NF1 microdeleti, rispetto ai pz con NF1 classica. Questi studi hanno promosso la ricerca di geni della regione 17q11.2 implicati nell'insorgenza di RM e AC. Due geni importanti per lo sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC), CDK5R1 e OMG, sono stati sottoposti ad analisi mutazionale in pz con RM aspecifico: in entrambi i geni sono state identificate nuove mutazioni e nuovi polimorfismi, sia nella regione codificante che nelle regioni UTR. Data la particolare estensione del 3'UTR di CDK5R1, è stato intrapreso uno studio funzionale per la ricerca di elementi regolatori (ER) post-trascrizionali, potenziali bersagli di mutazioni patogenetiche. Saggi di Dual Luciferase hanno permesso di identificare motivi di sequenza che diminuiscono o aumentano l'espressione del gene reporter, influenzando la stabilità del messaggero. Sono stati inoltre predetti numerosi siti di legame a miRNA, per nove dei quali è stato stabilito il profilo d'espressione in sei linee cellulari. Per quanto riguarda la ricerca di geni implicati nelle AC, abbiamo focalizzato l'attenzione su SUZ12, CENTA2 e UTP6, che sono espressi nelle prime fasi di sviluppo. Studi di ibridazione in situ (ISH) whole-mount su embrioni di topo hanno evidenziato che CENTA2 è espresso precocemente nel cuore, a partire in da 9-9.5 giorni di sviluppo embrionale, periodo nel quale avviene il looping cardiaco e iniziano a formarsi le quattro camere cardiache.
Obiettivi del progetto saranno quindi: 1) verificare l¿attività degli ER identificati mediante mutagenesi e cotrasfezione con oligonucleotidi antisenso; 2) verificare il legame degli ER identificati con fattori regolatori post-trascrizionali mediante saggi REMSA, UV cross-linking e immunoprecipitazione; 3) validare i siti target per miRNA mediante esperimenti di co-trasfezione con gli stessi miRNA e con antagomir; 4) estendere mediante DHPLC lo screening mutazionale di CDK5R1 a 400 pz con RM aspecifico, considerando la regione codificante e il 3'UTR in corrispondenza degli ER post-trascrizionali identificati; 5) studiare l'espressione di Centa2 mediante immunoistochimica su sezioni di cuore di embrioni di topo a diversi stadi di sviluppo; 6) estendere gli esperimenti di ISH a zebrafish, per verificare l¿espressione di Centa2 nel cuore in un organismo filogeneticamente più distante dall'uomo e eventualmente effettuare studi funzionali con oligo Morpholino, per confermare il ruolo di questo gene nello sviluppo del cuore.
Questo progetto, oltre a contribuire all'identificazione di nuovi geni e meccanismi implicati nello sviluppo del cuore e del SNC, fornirà utili evidenze per studi di correlazione genotipo-fenotipo nella sindrome da microdelezione NF1.