Uso degli inibitori delle istone deacetilasi in protocolli di amplificazione ex vivo di cellule progenitrici endoteliali umane
Progetto Presupposti ed obiettivi della ricerca
Le cellule CD34+ e CD133+ del sangue placentare e midollare sono progenitori con potenzialità differenziativa in senso ematopoietico ed endoteliale. Mentre diversi studi in modelli preclinici di ischemia cardiaca a periferica hanno mostrato che la somministrazione di progenitori endoteliali hanno un potente effetto angiogenico, relativamente sconosciuti sono i meccanismi che sono alla base del differenziamento endoteliale di questi progenitori. Il progetto in questione aspira a chiarire alcuni di questi meccanismi, e di giungere a protocolli di espansione ex vivo che permettano di ottenere popolazioni pure di cellule con capacità differenziativa endoteliale da utilizzare in pazienti affetti da ischemia del miocardio.
Descrizione della ricerca
In accordo con dati di letteratura già disponibili, la staminalità delle cellule CD34+ e/o CD133+ estratte da sangue placentare o midollare verrà studiata mediante analisi di citofluorimetria a flusso (FACS) e correlata con la proliferazione indotta dal trattamento con citochine mitogeniche (IL3/6, SCF e Flt3-L). Nello specifico, le cellule staminali verranno stimolate in coltura mediante un cocktail di citochine comprendenti IL3/6, Flt3L, SCF e TPO. Curve di crescita in presenza di acido valproico (VPA) e Tricostatina A (TSA) verranno eseguite allo scopo di verificare se, come atteso, queste sostanze determinino un rallentamento del ciclo cellulare indotto dalle citochine. Il range di concentrazione utilizzato sarà tra 1 e 20mM per il VPA e 1-20 nM per la TSA. Verranno effettuate analisi del ciclo cellulare delle cellule trattate e non con HDACi, per verificarne eventuali modificazioni. Saggi di acetilazione degli istoni mediante tecniche convenzionali (W-blot) completeranno queste osservazioni allo scopo di studiare la correlazione tra l'attività deacetilasica e l'effetto sulla staminalità dei progenitori. Infine, per verificare l'effetto del trattamento con HDACi sull'espressione di geni coinvolti nella regolazione dei marcatori di staminalità, verranno effettuati esperimenti di real-time PCR per verificare se il trattamento con HDACi determini una modulazione di geni che sono noti controllare il self renewal, la proliferazione ed il differenziamento in senso endoteliale.
L'analisi fenotipica delle cellule trattate verrà effettuata mediante esperimenti di citofluorimetria marcando le cellule trattate e non con anticorpi monoclonali diretti contro antigeni di superficie ematopoietici (CD14, CD45, CD29, Lin), mesenchimali (CD105, CD90) ed endoteliali (CD31, CD144, CD146, VEGFR-2/KDR), mediante esperimenti di uptake di LDL acetilato e mediante osservazioni morfologiche e di immunoistochimica.
L'attività angiogenica delle cellule trattate e non con HDACi verrà infine studiata mediante valutazione della attività di formazione di colonie endoteliali (CFU-EC assay) e mediante esperimenti su matrigel per verificare la formazione di capillaries-like structures.