ALBUMINOMICA: CARATTERIZZAZIONE E QUANTIZZAZIONE MEDIANTE SPETTROMETRIA DI MASSA DI MODIFICAZIONI OSSIDATIVE POST-TRASDUZIONALI DELL'ALBUMINA UMANA QUALI BIOMARKERS PRECOCI DI STRESS OSSIDATIVO
Progetto L'albumina umana (SA) è il principale antiossidante plasmatico (il tiolo del residuo Cys34 nell'uomo rappresenta circa l'80% dei tioli plasmatici totali), e gioca un ruolo chiave come regolatore redox nei compartimenti extracellulari, costituendo la prima linea di difesa nei confronti dell'attacco radicalico. Pertanto, la caratterizzazione e la determinazione quantitativa delle modificazioni ossidative sul residuo Cys34 assumono particolare importanza, in quanto consentono non solo di individuare nuovi biomarkers predittivi di danno ossidativo a livello vascolare, ma anche di chiarire il livello di implicazione di tali modifiche post-trasduzionali nelle patologie su base ossidativa. Studi già intrapresi su soggetti uremici (in corso di pubblicazione), hanno consentito di identificare le principali macro-modifiche covalenti a carico della Cys34 (forme glicata e cisteinilata). Sulla base dell'esperienza acquisita nell'ambito della proteomica e albuminomica [Rif.1-10], e della disponibilità di strumentazione idonea (2 sistemi LC-MS/MS ed uno spettrometro di massa ad elevata risoluzione), la ricerca si focalizzerà sullo studio, mediante spettrometria di massa, delle modifiche covalenti della SA in campioni di plasma di soggetti affetti da patologie su base ossidativa. Lo studio delle macro-modifiche covalenti (dopo isolamento della SA per cromatografia di affinità) saranno condotte in spettrometria di massa ESI-MS (infusione diretta) utilizzando uno spettrometro di massa con analizzatore a triplo quadrupolo. Questo approccio consente di evidenziare, oltre alla forma glicata, tutti i disolfuri misti con cisteina, cisteiniglicina, omocisteina, gamma-glutamilcisteina o glutatione, e di deterrminarne i relativi livelli mediante opportuni algoritmi. L'identificazione e caratterizzazione strutturale della modifica, così come il sito di adduzione, sarà effettuata mediante analisi LC-ESI-MS/MS del digerito triptico. Un metodo LC-MS/MS in modalità precurson-ion scan (triplo quadrupolo), recentemente sviluppato (Aldini G. et al., A tandem MS precursor ion scan approach for the identification of variable covalent modification of albumin Cys34: a new tool to study vascular carbonylation, J. Mass Spectrom, 2008) sarà applicato per identificare tutte le modifiche incognite a carico dei residui più nucleofili della SA, oltre alla Cys 34 (Lys e His). Per le modifiche a basso peso molecolare, come la Cys-nitrosilazione (la S-nitrosoalbumina è un importante forma di trasporto dell'NO a livello plasmatico il cui ruolo nel danno ossidativo/nitrosativo è a tutt'oggi ignoto per mancanza di tecniche analitiche specifiche), verrà utilizzato uno spettrometro di massa a trappola orbitalica ad alta risoluzione. Lo stesso approccio sarà applicato allo studio dell'ossidazione del residuo Cys34 ad acido sulfenico, sulfinico e sulfonico (Cys-SOH, Cys-SO2H, Cys-SO3H) e alla messa a punto di un metodo di analisi quantitativa per la loro determinazione a livello plasmatico.