VALUTAZIONE DELLE VARIAZIONI CIRCADIANE DELLA RESPONSIVITÀ DEGLI OSTEOBLASTI UMANI ALLA CICLOSPORINA A

- Introduzione La periodicità circadiana delle attività cellulari è regolata da un gruppo di geni che sono espressi con variazioni nelle 24 ore sia nel sistema nervoso centrale che nei tessuti periferici. Variazioni circadiane nell'espressione di "clock genes" possono essere evidenziate anche in vitro, dopo aver sottoposto le cellule ad uno stimolo adeguato. E' possibile così definire modelli di cellule sincronizzate da utilizzare per studi in vitro relativi alla periodicità circadiana delle attività cellulari e della loro responsività a sostanze somministrate. La ciclosporina A, farmaco ampiamente utilizzato per l'attività immunosoppressiva, può indurre anche effetti indesiderati e complicanze come una severa osteoporosi. I dati disponibili relativi agli effetti di questo farmaco sul turnover osseo sono discordanti, con l'evidenza sia di un incremento della formazione di tessuto osseo sia, al contrario, di osteopenia. Studi recenti hanno evidenziato effetti opposti della ciclosporina A sulla formazione di tessuto osseo in relazione alla dose somministrata ed effetti sul riassorbimento osseo dipendenti dall'ora di somministrazione del farmaco nell'arco delle 24 ore. La responsività degli osteoblasti alla ciclosporina A potrebbe dunque essere caratterizzata da periodicità circadiana; il turnover del collagene, regolato dalla sintesi di enzimi proteolitici come le metalloproteinasi ed i loro inibitori, potrebbe variare non solo in relazione alla dose di farmaco somministrata ma anche al tempo iniziale di somministrazione, modificando la quantità di matrice extracellulare disponibile per la mineralizzazione. - Materiali e metodi Colture primarie di osteoblasti mandibolari umani verranno incubate in terreno di coltura 199 con il 10% di siero fetale bovino. Al fine di ottenere la sincronizzazione delle cellule, al 4° passaggio gli osteoblasti verranno sottoposti ad uno shock sierico, mediante incubazione per 2 ore nel medesimo terreno di coltura con il 50% di siero fetale bovino. Ogni 4 ore per 24 ore verrà estratto l'RNA totale e, mediante real time PCR, verrà valutata l'espressione di clock genes (Per1, Cry1 e Bmal1). L'analisi ritmometrica dei dati, effettuata con il metodo statistico del singolo cosinor, consentirà di verificare la sincronizzazione delle cellule. A 6, 12, 18 o 24 ore dal termine dello shock sierico, osteoblasti verranno incubati per 24 ore con terreno di coltura 199 e ciclosporina A a due differenti concentrazioni (1microM e 25microM). Per ogni campione verrà quindi valutata l'espressione dei geni per il collagene 1, le metalloproteinasi (MMP-2 e MMP-9) ed il loro inibitore TIMP-1. L'analisi dei dati verrà effettuata mediante ANOVA. - Obiettivo Valutazione degli effetti della ciclosporina A sul turnover del collagene in colture primarie di osteoblasti mandibolari umani, in relazione alla dose somministrata e a partire da tempi diversi nelle 24 ore.