Ruolo del cloro nell'attività dei cotrasportatori di amino acidi di insetto KAAT1 e CAATCH1
Progetto KAAT1 e CAATCH1 sono due trasportatori altamente omologhi (90% di identità di sequenza) che sono stati clonati dall' intestino medio della larva di lepidottero Manduca sexta (Castagna et al., PNAS, 95: 5395-5400, 1998; Feldman et al., J. Biol. Chem., 275: 24518-24526, 2000). Entrambe i trasportatori appartengono alla famiglia dei trasportatori di neurotrasmettitori sodio e cloro dipendenti NSS o SLC6, di cui fanno parte i trasportatori del GABA GAT, della serotonina SERT, della dopamina DAT e della noradrenalina NET.
Recentemente è stata risolta la struttura cristallina di un membro batterico della famiglia, il trasportatore di amino acidi LeuTAa (Yamashita et al., Nature, 437: 215-223, 2005) offrendo la possibilità di conoscere in maggior dettaglio la fisiologia molecolare dei trasportatori appartenenti alla famiglia. L'analisi della struttura di LeuTAa non ha però chiarito il ruolo svolto dal cloro nella funzione dei trasportatori NSS, infatti nel cristallo il cloro risulta posizionato a livello di un loop extracellulare e distante dal sito di binding per i substrati trasportati. L'interazione con il cloro è stata studiata in due laboratori che hanno confrontato la struttura del trasportatore cloro indipendente LeuTAa con quella dei trasportatori cloro dipendenti GAT1, GAT4 e SERT (Forrest et al., PNAS, 104: 12761-12766, 2007; Zomot et al., Nature, 449: 726-730, 2007). E' stato così possibile mettere in evidenza la funzione svolta dal residuo Glu290 di LeuTAa. Questo residuo è assente in tutti i membri della famiglia ed è sostituito nei trasportatori cloro dipendenti GAT1, GAT4 e SERT da una serina. Inoltre, l'Asn286 di LeuTAa, che prende parte alla coordinazione del Na+ nel sito di binding Na1, risulta coordinare anche il Cl- in SERT e GAT1. La conclusione delle due analisi è stata che la presenza di una carica negativa nel o vicino al sito di binding del Na+, fornita o dal Cl- o dallo stesso trasportatore (dal Glu290 in LeuTAa), è necessaria per la funzione del cotrasportatore, probabilmente per controbilanciare la carica dei cationi trasportati.
Considerando questi risultati, lo scopo del presente progetto sarà quello di investigare la dipendenza da cloro di KAAT1 e di CAATCH1 che presentano un residuo di serina nella posizione corrispondente al Glu290 di LeuTAa (il che suggerisce cloro dipendenza) ma che, nella posizione dell'Asn286 di LeuTAa hanno un aspartato (Asp338) che abbiamo dimostrato essere coinvolto nell'interazione col K+, nell'accoppiamento aminoacido-catione (Mari et al, Cell. Mol. Life Sci., 61: 243-256, 2004) e nell' interazione strutturale e funzionale con il residuo K102 in KAAT1 (Castagna et al., Am J. Physiol, 293, C1286-C1295, 2007). Il ruolo svolto dal cloro nell'attività di trasporto indotta da KAAT1 wt, CAATCH1 wt e dai rispettivi mutanti sarà studiato esprimendo i trasportatori in oociti di Xenopus laevis, mediante l'iniezione del cRNA corrispondente, e misurando i flussi di amino acidi radio marcati.