Background dello studio. I gliomi sono i tumori primari del sistema nervoso più comuni, rappresentandone più del 40% (1). Fra i gliomi di derivazione astrocitaria, si riconoscono quattro principali gradi di malignità, fra cui il glioblastoma (grado IV) è il più maligno e tipicamente colpisce soggetti adulti dell'età compresa fra i 45 e i 60 anni (2). Il glioblastoma è un tumore altamente aggressivo ed invasivo,caratterizzato da una prognosi sfavorevole,anche in risposta a strategie terapeutiche multidisciplinari.
Il pattern di invasività e di diffusione nei tessuti circostanti differisce da quello degli altri tumori, in quanto l'infiltrazione dei tessuti circostanti da parte delle cellule di glioma non necessita di vasi sanguigni o linfatici, poiché tali cellule invadono direttamente i tessuti che le circondano. In questo meccanismo l'interazione glioma-astrocita gioca un ruolo chiave, in quanto può determinare una attivazione degli astrociti ed una trasformazione del loro fenotipo che può contribuire al favorire l'invasività del glioma stesso. Tale interazione è mediata dalle gap junctions, in cui la connessina maggiormente espressa è la connessina 43 (CX43) (3, 4).
Scopo dello studio. Questo studio prevede l'analisi dell'interazione fra glioma e astrocita, al fine di caratterizzarne l'effetto sul fenotipo dei 2 tipi cellulari. Verranno analizzati separatamente i 2 tipi cellulari dopo un tempo di co-cultura, in modo da evidenziare eventuali modificazioni fenotipiche causate da tale interazione.
Astrociti e cellule di glioma (U87) verranno co-coltivate in un sistema transwell. Dopo una prima fase in cui verranno messe a punto le condizioni di coltura, verranno analizzati i seguenti parametri: morfologia di astrociti e glomi, espressione di geni e proteine correlati con i meccanismi di invasività neoplastica, espressione della GFAP, espressione della CX43.
Materiali e Metodi.
Colture cellulari: verranno utilizzate cellule di astrocitoma anaplastico U87 e astrociti ottenuti dal differenziamento di cellule staminali neurali, in un modello di co-coltura in transwell.
Analisi morfologica: analisi della morfologia cellulare al microscopio e determinazione del pattern di espressione della GFAP mediante immunofluorescenza.
Espressione genica: analisi dei livelli di mRNA di MMP-2, TIMP-2, SPARC, CX43 mediante real-time RT-PCR.
Analisi delle proteine: valutazione dei livelli proteici di MMP-2 e 9 mediante SDS-zimografia, e di SPARC mediante western blot nei terreni di coltura. Per quanto concerne le proteine cellulari, verranno analizzati mediante western blot i livelli di CX43 e le eventuali modificazioni post-traduzionali (fosforilazione), e l'espressione della GFAP.
Bibliografia
1) Kleihues P, Soylemezoglu F, Schauble B, Scheithauer BW, Burger PC. Glia 1995; 15: 211-21.
2) Sehgal A. Semin Surg Oncol 1998; 14: 3-12.
3) Zhang et al. Cancer Res 1999; 59: 1994-2003.
4) Lin JH et al. J Neurosci 2002; 22: 4302-4311.