Negli organismi eucarioti più evoluti, l¿oncosoppresssore p53 svolge un ruolo fondamentale nella risposta cellulare ad una serie di stimoli extra-cellulari che inducono danno al DNA. Le due proteine p73 e p63 sono fattori di trascrizione omologhi a p53. Oltre ai domini conservati, la loro regione C-terminale contiene il dominio SAM, trovato in più di 40 proteine coinvolte nella regolazione dello sviluppo. I geni p63/p73 possiedono due diversi siti di inizio della trascrizione, che generano proteine con (TA) o senza (DN) dominio di attivazione trascrizionale. Inoltre, la regione 3¿ dei geni può subire numerosi splicing alternativi, che danno origine ad almeno tre isotipi proteici: alpha, beta e gamma. Pertanto, a livello cellulare, esistono almeno sei isoforme diverse di p63/p73, differenzialmente espresse.
Studi genetici evidenziano che p63 è fondamentale per lo sviluppo ectodermico: (i) diversamente dai topi KO per p53, che nascono normali, i topi privi di p63 muoiono appena dopo la nascita con sviluppo difettivo degli arti, craniofacciale e della pelle. (ii) Le sindromi umane EEC, SHFM e AEC, caratterizzate da anormalità degli arti e della pelle, sono causate da mutazioni del gene p63. Infine, considerando il ruolo chiave di p63 negli epiteli stratificati, esso è stato identificato come marcatore di cheratinociti staminali.
E' stato disegnato e prodotto da noi un microarray a bassa densità definito MARM. Per ognuno dei 179 promotori target sono stati disegnati tre diversi oligo di 50 nucleotidi. Questo reagente è stato validato per target di NF-Y e di p53. Il nostro scopo è quello di migliorare i MARM, generando una versione dell¿array con più promotori target specificamente di p63.
La versione aggiornata dei MARM ¿MARM2- verrà utilizzata per analizzare il legame in vivo di cofattori che svolgono un ruolo negativo nell¿attività di un promotore. Abbiamo già disegnato gli oligo per altri 160 promotori, contenenti 30 siti di legame per p53 in vivo, come descritti in letteratura, 60 target di p63 da noi identificati usando la tecnica ChIP on chip ed esperimenti di silenziamento genico (siRNA) nei cheratinociti e promotori di geni importanti nella regolazione del ciclo cellulare, in particolare che agiscono nella transizione G2/M. L¿insieme di questi oligonucleotidi, associati a quelli inclusi nel MARM-1 costituiscono il MARM-2.
Pertanto, pensiamo che la produzione e la validazione del MARM-2 migliorerà significativamente gli esperimenti di ChIP sul legame in vivo di p63 e di cofattori. Inizieremo a testare questo reagente con cheratinociti umani primari cresciuti in vitro e valuteremo poi il pannello di target di p63 in campioni di biopsia umane di cute ottenute prima e dopo danno al DNA ottenuto da irraggiamento.