Caratterizzazione del complesso della chinolinato sintasi implicato nella biosintesi del NAD(P) nei procarioti

La biosintesi del NAD(P) rappresenta una via metabolica cruciale in ogni organismo, con profonde differenze fra eucarioti e procarioti ed un elevato grado di conservazione all'interno di questi ultimi, inclusi molti patogeni. Per tale motivo le proteine coinvolte nel metabolismo del NAD(P), ed in particolare i primi due enzimi che catalizzano la biosintesi de novo del NAD e che sono presenti solo nei procarioti, sono considerati un importante potenziale bersaglio per terapie antibiotiche innovative. Precedenti ricerche da parte del nostro gruppo hanno permesso la caratterizzazione biochimica di tali enzimi, denominati NadA e NadB sia da organismi modello gram- (E. coli) che gram + (B. subtilis). Alcuni autori hanno proposto che tali enzimi costituiscano un complesso multienzimtico denominato chinolinato sintasi, ma finora tale ipotesi non è stata supportata da alcuna reale evidenza sperimentale. La presente ricerca si propone di valutare l'esistenza di tale complesso mediante un doppio approccio biochimico e proteomico utilizzando NadA e NadB da B. subtilis recentemente sovraespresse e purificate in forma attiva. Si è scelto questo importante organismo modello in quanto è in atto una collaborazione con il laboratorio di genetica dei microrganismi l'Università di Pavia (Prof.ssa Albertini) per la valutazione della regolazione a livello genetico e metabolico di questi enzimi in vivo in B. subtilis. Per quanto concerne l'approccio biochimico si valuteranno: (a) l'effetto della NadA sulle caratteristiche spettroscopiche e di fluorescenza della NadB dovute alla presenza in quest'ultima del coenzima flavinico. E' infatti ipotizzabile che l'eventuale legame di NadA con NadB porti ad una variazione quali-quantitativa di tali caratteristiche della NadB; (b) lo stato di aggregazione di NadA e NadB isolate o in miscela mediante gel filtrazione per HPLC; (c) l'effetto della presenza di NadB sulla stabilità della NadA in condizioni sia aerobiche che anaerobiche; (d) la modulazione dell'attività L-aspartato ossidasica della NadB da parte di NadA. L'approccio proteomico implica (e) la valutazione dell'associazione tra NadA e NadB mediante cromatografia di affinità. NadA o NadB saranno alternativamente immobilizzate su opportune colonne ed utilizzate come ligandi per verificare il legame dell'altra proteina sia a partire dalle proteine pure sia a partire da estratti proteici totali di B. subtilis. In quest'ultimo caso, le proteine legatesi alla NadA o NadB utilizzata come ligando immobilizzato alla colonna saranno eluite ed identificate mediante elettroforesi e caratterizzate mediante spettrometria di massa MALDI-TOF e sequenziamento N-terminale. Ciò permetterà da un lato di confermare l'associazione tra NadA e NadB, dall'altro di identificare eventuali altre proteine con esse funzionalmente correlate.