Cristallizzazione e analisi della struttura tridimensionale del globin-coupled sensor esacoordinato da Geobacter sulfurreducens
Progetto Recentemente sono state identificate diverse proteine caratterizzate come "sensori ad eme" in grado di fornire una risposta strutturale adattatoria a seguito del legame di messaggeri fisiologici quali O2, CO e NO. Tali proteine sono costituite da un dominio sensore-regolatorio, che contiene il gruppo eme, e da un dominio (o regione) di trasmissione del segnale. In particolare, in batteri ed in un archeo-batterio è stata identificata la presenza di sensori ad eme aventi il dominio regolatorio di tipo globinico ("globin coupled sensors" o GCS) di cui però, ad oggi, è nota soltanto una struttura 3D. La ricerca PUR qui presentata propone la determinazione della struttura 3D del dominio globinico (162 a.a.) del GCS da Geobacter sulfurreducens, il cui studio è di particolare rilevanza, considerato che tale GCS è l'unico finora noto che presenti un dominio di trasmissione transmembrana e che, secondo dati preliminari spettroscopici, il dominio regolatorio globinico dovrebbe presentare un gruppo eme esacoordinato in assenza del ligando esogeno. Tale meccanismo di legame è di grande interesse poiché costituisce un evento strutturalmente complesso che include: (i) la rottura del sesto legame endogeno di coordinazione distale del ferro del gruppo eme che, come per il legame di coordinazione prossimale, risulterebbe coordinato ad un residuo His della proteina; (ii) la formazione transiente di una specie reattiva pentacoordinata; (iii) il legame del ligando esogeno nel sito di sesta coordinazione (distale) del ferro del gruppo eme. Uno screening preliminare di cristallizzazione ha consentito di individuare una condizione in cui si formano monocristalli della proteina (ricombinante) di G. sulfurreducens. Tali campioni cristallini saranno caratterizzati utilizzando luce di sincrotrone, eseguendo un esperimento di fasatura MAD (Multiple wavelength Anomalous Dispersion), che consiste nell'irraggiare il campione cristallino a lunghezze d'onda prossime alla soglia di assorbimento X dell'atomo di ferro. Tale esperimento consentirà di localizzare la posizione degli atomi di ferro del gruppo eme nel cristallo e di calcolare una distribuzione di densità elettronica in cui costruire il modello molecolare dell'intera proteina. Lo studio programmato fornirà le prime indicazioni sul fold e sulla struttura del sito distale dell'eme in GCS esacoordinati, nonchè indicazioni evolutive più generali per la super-famiglia dell'emoglobina, esaminando varianti di questo "fold proteico" che hanno adottato una specializzazione funzionale del tutto distinta da quella di un trasportatore di ossigeno. Verranno, inoltre, correlate le proprietà strutturali della proteina con quelle funzionali, per esempio determinando le costanti di equilibrio e le cinetiche di legame per ligandi biatomici.