Sviluppo di nuove metodologie per lo studio del meccanismo d'azione dei farmaci antimalarici
ProjectLa malaria è una malattia infettiva che provoca ogni anno 1.5-2.7 milioni di decessi. Lo studio del meccanismo d¿azione degli antimalarici noti è fondamentale per la ricerca di nuovi farmaci. Plasmodium falciparum (Pf) utilizza l'emoglobina del globulo rosso come nutrimento e detossifica i gruppi eme formando emozoina. Questo processo è specifico per Pf e rappresenta un bersaglio selettivo per i farmaci: quelli di tipo chinolinico (es clorochina), formando complessi con l¿eme, inibiscono la formazione di emozoina, mentre quelli endoperossidici (artemisinina e derivati), si pensa vengano attivati dal ferro-eme a radicali tossici (Haynes RK et al, AAC 2003). Tuttavia i dati disponibili sono controversi. Al fine di chiarire il ruolo dell¿eme e dello stress ossidativo nel meccanismo d¿azione di questi farmaci, abbiamo recentemente messo a punto una metodica che permette di variare la quantità di emoglobina e la concentrazione di antiossidanti quali il glutatione ridotto (GSH) nei globuli rossi. Tale metodica prevede apertura (con soluzione ipotonica) e successiva chiusura (con soluzione ipertonica) dei globuli rossi e permette di ottenere eritrociti contenenti concentrazioni di emoglobina fino a 4 volte inferiore rispetto al normale. In questi eritrociti il parassita cresce normalmente senza alterazioni morfologiche. Inoltre, l¿attività di CQ è inversamente proporzionale alla concentrazione di emoglobina presente nei globuli rossi. Sulla base di questi risultati, ci proponiamo i seguenti obiettivi specifici:
1) Analisi del ruolo dell¿emoglobina nella sensibilità di Pf a farmaci noti o di neosintesi.
La metodica precedentemente messa a punto verrà utilizzata per valutare se, al pari di CQ, anche l¿attività di altre chinoline note (amodiachina, chinino) o di recente sintesi da parte di collaboratori dell¿ateneo (Sparatore et al. 2005) sia influenzata dalla quantità di emoglobina, in modo da ottenere indicazioni utili circa il loro meccanismo d¿azione. Anche artemisinina e derivati saranno studiati con la medesima metodica. Di questa classe di molecole, verranno utilizzati, in particolare, nuovi derivati sintetizzati dal Prof. Haynes (Università di Hong Kong) e modificati in modo da non poter essere attivati dal ferro-eme. Ci aspettiamo, pertanto, che la loro attività non venga influenzata da concentrazioni diverse di emoglobina.
2) Analisi del ruolo del GSH o di altri agenti antiossidanti nella sensibilità di Pf ai farmaci.
E¿ noto che il GSH svolge un ruolo protettivo nei confronti di CQ. Grazie alla metodica sopra descritta , abbiamo inserito diverse concentrazioni di GSH nei globuli rossi; abbiamo, inoltre, messo a punto un metodo di dosaggio del GSH in micropiastre. Ci proponiamo quindi di valutare la sensibilità di Pf ai farmaci in presenza di diverse concentrazioni di GSH o altri agenti riducenti (NAC, cisteina) in atmosfere di crescita del parassita contenenti diverse quantità di ossigeno.
1) Analisi del ruolo dell¿emoglobina nella sensibilità di Pf a farmaci noti o di neosintesi.
La metodica precedentemente messa a punto verrà utilizzata per valutare se, al pari di CQ, anche l¿attività di altre chinoline note (amodiachina, chinino) o di recente sintesi da parte di collaboratori dell¿ateneo (Sparatore et al. 2005) sia influenzata dalla quantità di emoglobina, in modo da ottenere indicazioni utili circa il loro meccanismo d¿azione. Anche artemisinina e derivati saranno studiati con la medesima metodica. Di questa classe di molecole, verranno utilizzati, in particolare, nuovi derivati sintetizzati dal Prof. Haynes (Università di Hong Kong) e modificati in modo da non poter essere attivati dal ferro-eme. Ci aspettiamo, pertanto, che la loro attività non venga influenzata da concentrazioni diverse di emoglobina.
2) Analisi del ruolo del GSH o di altri agenti antiossidanti nella sensibilità di Pf ai farmaci.
E¿ noto che il GSH svolge un ruolo protettivo nei confronti di CQ. Grazie alla metodica sopra descritta , abbiamo inserito diverse concentrazioni di GSH nei globuli rossi; abbiamo, inoltre, messo a punto un metodo di dosaggio del GSH in micropiastre. Ci proponiamo quindi di valutare la sensibilità di Pf ai farmaci in presenza di diverse concentrazioni di GSH o altri agenti riducenti (NAC, cisteina) in atmosfere di crescita del parassita contenenti diverse quantità di ossigeno.