INDICI DI TURNOVER DEL COLLAGENE IN FIBROBLASTI GENGIVALI UMANI SINCRONIZZATI: VALUTAZIONE DEGLI EFFETTI DELLA SOMMINISTRAZIONE DI CICLOSPORINA A IN TEMPI DIVERSI.

Introduzione La periodicità circadiana dei fenomeni biologici coinvolge un gruppo geni che sono espressi con variazioni nelle 24 ore sia nel sistema nervoso centrale che nei tessuti periferici. Variazioni circadiane nell¿espressione di ¿clock genes¿ possono essere evidenziate anche in vitro, dopo aver sottoposto le cellule ad uno stimolo adeguato. Ciò permette di definire modelli di cellule sincronizzate da utilizzare per studi in vitro relativi alla periodicità circadiana delle attività cellulari. Poiché l¿efficacia o gli effetti indesiderati di un farmaco possono essere maggiori o minori in relazione al tempo di somministrazione, l¿utilizzo di modelli di colture di cellule sincronizzate potrebbe evidenziare l¿esistenza di variazioni nelle 24 ore della responsività cellulare all¿esposizione a sostanze. La ciclosporina A, farmaco ampiamente utilizzato per l¿attività immunosoppressiva, può indurre anche effetti tossici che dipendono dalla dose e dal tempo di somministrazione, ed effetti indesiderati come l¿ipertrofia gengivale, dovuta ad una alterazione del turnover del collagene, con una eccessiva deposizione di matrice extracellulare nel tessuto connettivale. La responsività dei fibroblasti alla ciclosporina A potrebbe essere caratterizzata da periodicità circadiana ed il turnover del collagene, regolato dalla sintesi di enzimi proteolitici come le metalloproteinasi ed i loro inibitori, potrebbe variare in relazione al tempo iniziale di somministrazione del farmaco. Materiali e Metodi Colture primarie di fibroblasti gengivali umani verranno incubate in terreno di coltura DMEM con il 10% di siero fetale bovino. Al fine di ottenere la sincronizzazione delle cellule, al 4° passaggio i fibroblasti verranno sottoposti ad uno shock sierico, mediante incubazione per 2 ore nel medesimo terreno di coltura con il 50% di siero fetale bovino. Ogni 4 ore per 24 ore verrà estratto l¿RNA totale e, mediante real time PCR, verrà valutata l¿espressione di clock genes (Per1, Cry1 e Bmal1). L¿analisi ritmometrica dei dati, effettuata con il metodo statistico del singolo cosinor, consentirà di verificare la sincronizzazione delle cellule. A 6, 12, 18 o 24 ore dal termine dello shock sierico, fibroblasti verranno incubati per 24 ore con terreno di coltura DMEM contenente 800 ng/ml di ciclosporina A. Per ogni campione verrà quindi valutata l¿espressione dei geni per il collagene I e III, per la metalloproteinasi-1 e per l¿inibitore delle metalloproteinasi TIMP1. Obiettivo Valutazione degli effetti della ciclosporina A sul turnover del collagene in colture di fibroblasti gengivali umani sincronizzati, somministrata a partire da tempi diversi nelle 24 ore.