APPROCCIO PROTEOMICO IN SPETTROMETRIA DI MASSA PER LA CARATTERIZZAZIONE E LA QUANTIZZAZIONE DI ADDOTTI COVALENTI DA CARBONILAZIONE ALL¿ALBUMINA UMANA QUALI BIOMARKERS PRECOCI DI PATOLOGIE CARDIOVASCOLARI
Progetto I prodotti di perossidazione lipidica contenenti una funzione cheto/aldeidica (RCS) agiscono da importanti mediatori citotossici, inducendo modifiche strutturali di tipo irreversibile a carico di biomolecole con conseguente alterazione della funzionalità cellulare. Gli studi intrapresi negli anni precedenti per la definizione dei processi di carbonilazione a carico di peptidi e proteine in sistemi in vitro hanno consentito, attraverso l¿impiego di metodiche analitiche in spettrometria di massa (LC-MS/MS), di ottimizzare le condizioni strumentali ai fini della caratterizzazione di tali modifiche. Si è inoltre potuto dimostrare che peptidi endogeni contenenti gruppi tiolici (GSH) e/o istidinici quali carnosina (beta-alanil-L-istidina), sono potenti quencher dei composti carbonilici reattivi (idrossinonenale e acroleina), e che le principali proteine bersaglio dei processi di carbonilazione sono l¿actina a livello cellulare e l¿albumina a livello plasmatico. Alla luce di queste premesse, e della disponibilità di strumentazione idonea (2 sistemi LC-MS/MS), la ricerca si propone di estendere gli studi alla determinazione quantitativa di tali modifiche, ai fini del loro utilizzo quali biomarkers inequivocabili e riproducibili di stress carbonilico sia in modelli cellulari che in vivo (tessuti e fluidi biologici). In particolare, attraverso un approccio di peptidomica/proteomica e l¿impiego di metodologie LC-MS/MS, verranno studiati i processi di carbonilazione di peptidi endogeni e proteine (albumina e actina) sia nell¿animale (ratto Zucker obeso quale modello di rischio cardiovascolare) che in soggetti che condividono la via ultima comune del danno cardiovascolare tramite attivazione dello stress carbonilico (uremici, diabetici, ipertesi). Studi già intrapresi su soggetti uremici hanno consentito di identificare le principali macro-modifiche covalenti a carico dell¿albumina (forme glicate e cisteinilate), e sono in corso di definizione le micromodifiche covalenti a carico dei residui nucleofili Cys34, Lys199 e His146. In parallelo, il gruppo del Prof. Koji Uchida con cui è già in atto una collaborazione (Identification of actin as a 15-deoxy-Delta12,14-prostaglandin J2 target in neuroblastoma cells: mass spectrometric, computational and functional approaches to investigate the effect on cytoskeletal derangement. G. Aldini, M. Carini, G. Vistoli, K. Uchida et al. Biochemistry 2007;46:2707-2718), convaliderà la metodologia attraverso un approccio proteomico convenzionale (SDS-PAGE bidimensionale e analisi immunoistochimica con anticorpi specifici). I risultati consentiranno di chiarire il livello di implicazione della carbonilazione proteica nelle patologie cardiovascolari, e quindi di individuare nuovi biomarkers predittivi e nuovi target per lo sviluppo di molecole biologicamente attive finalizzate alla prevenzione/trattamento delle patologie degenerative croniche, nella cui progressione i composti carbonilici sono ampiamente coinvolti.