Analisi dell'interazione tra proteina ribosomale S1 e polinucleotide fosforilasi di Escherichia coli
Progetto La polinucleotide fosforilasi (PNPasi, codificata da pnp) è una delle principali esonucleasi di Escherichia coli. Sebbene non sia essenziale a 37 °C, la PNPasi è essenziale per la crescita di E. coli a bassa temperatura; le basi molecolari di tale fenotipo non sono note. L¿espressione della PNPasi è regolata a livello post-trascrizionale, con un meccanismo in cui interviene la PNPasi stessa. Abbiamo dimostrato che sia la PNPasi che la proteina ribosomale S1 legano in vitro la regione 5¿ non tradotta dell¿mRNA pnp. Esperimenti di mappatura indicano un¿estesa sovrapposizione dei siti di legame di PNPasi e S1 e una competizione delle due proteine per l¿RNA bersaglio, suggerendo che la competizione tra S1 e PNPasi per il legame a siti comuni possa modulare la stabilità/degradazione dell¿mRNA pnp.
Nel corso di esperimenti mirati a definire il ruolo di S1 nella regolazione di pnp, abbiamo osservato che in vivo l¿iperespressione di S1 (espressione ectopica da un plasmide) stabilizza considerevolmente l¿mRNA pnp e altri mRNA di E. coli non correlati a pnp. Sorprendentemente, la stabilizzazione sia dell¿mRNA di pnp che degli altri messaggeri di controllo non si verifica in un mutante privo di PNPasi, suggerendo che, in presenza di un eccesso di S1, la PNPasi protegga l¿mRNA dall¿azione di altre nucleasi. Ci proponiamo di investigare questo fenomeno con diversi approcci:
- per verificare se la stabilizzazione PNPasi-dipendente dei messaggeri dipenda direttamente dall¿incremento di S1 o dal possibile malfunzionamento della traduzione conseguente a tale incremento, analizzeremo la stabilità dell¿mRNA pnp e di altri mRNA in presenza di antibiotici inibitori specifici della traduzione. Tali esperimenti saranno condotti in ceppi pnp+ e pnp-.
- saggeremo la possibile interazione fisica tra PNPasi e S1 mediante saggi di co-immunoprecipitazione. A questo scopo disponiamo già di anticorpi specifici per entrambe le proteine
- analizzeremo la distribuzione di PNPasi e S1 in estratti grezzi di E. coli frazionati su gradiente di saccarosio. Gli estratti saranno preparati a partire da colture cresciute a 37 °C e in fase di acclimatazione o acclimatate a bassa temperatura (15 °C).Questo ci consentirà di valutare la localizzazione delle due proteine l¿una rispetto all¿altra e rispetto alle subunità ribosomali, al ribosoma 70S e ai polisomi.
Da questa ricerca ci aspettiamo di acquisire una migliore comprensione di fenomeni ancora poco chiari, come la relazione tra efficienza traduzionale e degradazione dell¿RNA messaggero e l¿adattamento di E. coli al freddo.