Effetti degli ftalati sulla maturazione dell'ovocita e sul successivo sviluppo embrionale preimpianto nella specie suina
ProgettoE¿ stato dimostrato che numerosi contaminanti ambientali possono avere effetti negativi sulla salute riproduttiva di diverse specie animali (Colborn et al., 1993; Vos et al., 2000). Fra i contaminanti, gli ftalati destano particolare interesse a causa del loro ampio impiego come plastificanti nella manifattura di prodotti di uso comune (es. giocattoli per l¿infanzia, contenitori alimentari e attrezzature biomediche) e della loro capacità di interferire con l¿equilibrio endocrino (Latini et al., 2004). Fra gli ftalati, il di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) è il più utilizzato ed è stato dimostrato indurre tossicità riproduttiva nei roditori. In particolare, in ratti femmine sono state osservate: ridotta fertilità, anomalie morfologiche dell¿ovaio, mancata ovulazione e alterata steroidogenesi (Lovekamp-Swan et al., 2004). Il DEHP viene metabolizzato a mono(2-ethylhexyl)phthalate (MEHP), che presenta effetti negativi sulla riproduzione simili a quelli riscontrati per il DEHP, ma a dosaggi inferiori.
In base a queste informazioni appare evidente che l¿ovaio è un organo bersaglio per DEHP/MEHP. Tuttavia, le informazioni riguardanti gli effetti di questi composti sulla maturazione dell¿ovocita e lo sviluppo embrionale negli animali domestici sono attualmente scarse.
Scopo del progetto è di analizzare gli effetti del DEHP e del MEHP durante la maturazione degli ovociti, la fecondazione e lo sviluppo embrionale nella specie suina. Inoltre, gli effetti di modulazione dell¿attività endocrina saranno analizzati nelle cellule follicolari.
Complessi cumulo-ovocita (COCs) e cellule follicolari saranno prelevati da ovaie suine ottenute in sede di macellazione. I COCs verranno maturati e fecondati in vitro e i risultanti embrioni saranno coltivati fino allo stadio di blastocisti, in presenza o assenza di diverse quantità di DEHP e MEHP, allo scopo di determinare la minima dose efficace. Quali parametri di valutazione saranno analizzati la maturazione nucleare degli ovociti, la vitalità e il grado di apoptosi delle cellule del cumulo, la percentuale di embrioni in grado di sostenere la prima divisione mitotica e il numero delle blastocisti. Per le blastocisti verrà inoltre analizzato il numero delle cellule, il rapporto trofoectoderma/nodulo embrionale e il grado di apoptosi. In COCs e embrioni a diversi stadi di sviluppo sarà, inoltre, analizzata l¿espressione di un pannello di geni legati alla qualità dell¿ovocita e delle cellule del cumulo (GDF-9, BMP-15, c-Kit, Kit-L, COX2 e HAS2) e dell¿embrione (es. Bax, Cx43, LIF and LIF-R).
Parallelamente, colture primarie di cellule della teca interna e della granulosa murale verranno sottoposte a trattamento con diluizioni seriali di DEHP e MEHP. Al termine della coltura i campioni saranno analizzati per la proliferazione e vitalità cellulare e per l¿incidenza dell¿apoptosi. Inoltre verrà studiata l¿espressione genica e proteica di molecole legate alla funzionalità endocrina (es. ER alpha e beta, LH-R, FSH-R, PR).
In base a queste informazioni appare evidente che l¿ovaio è un organo bersaglio per DEHP/MEHP. Tuttavia, le informazioni riguardanti gli effetti di questi composti sulla maturazione dell¿ovocita e lo sviluppo embrionale negli animali domestici sono attualmente scarse.
Scopo del progetto è di analizzare gli effetti del DEHP e del MEHP durante la maturazione degli ovociti, la fecondazione e lo sviluppo embrionale nella specie suina. Inoltre, gli effetti di modulazione dell¿attività endocrina saranno analizzati nelle cellule follicolari.
Complessi cumulo-ovocita (COCs) e cellule follicolari saranno prelevati da ovaie suine ottenute in sede di macellazione. I COCs verranno maturati e fecondati in vitro e i risultanti embrioni saranno coltivati fino allo stadio di blastocisti, in presenza o assenza di diverse quantità di DEHP e MEHP, allo scopo di determinare la minima dose efficace. Quali parametri di valutazione saranno analizzati la maturazione nucleare degli ovociti, la vitalità e il grado di apoptosi delle cellule del cumulo, la percentuale di embrioni in grado di sostenere la prima divisione mitotica e il numero delle blastocisti. Per le blastocisti verrà inoltre analizzato il numero delle cellule, il rapporto trofoectoderma/nodulo embrionale e il grado di apoptosi. In COCs e embrioni a diversi stadi di sviluppo sarà, inoltre, analizzata l¿espressione di un pannello di geni legati alla qualità dell¿ovocita e delle cellule del cumulo (GDF-9, BMP-15, c-Kit, Kit-L, COX2 e HAS2) e dell¿embrione (es. Bax, Cx43, LIF and LIF-R).
Parallelamente, colture primarie di cellule della teca interna e della granulosa murale verranno sottoposte a trattamento con diluizioni seriali di DEHP e MEHP. Al termine della coltura i campioni saranno analizzati per la proliferazione e vitalità cellulare e per l¿incidenza dell¿apoptosi. Inoltre verrà studiata l¿espressione genica e proteica di molecole legate alla funzionalità endocrina (es. ER alpha e beta, LH-R, FSH-R, PR).