Effetti degli ftalati sulla maturazione dell'ovocita e sul successivo sviluppo embrionale preimpianto nella specie suina
Progetto E¿ stato dimostrato che numerosi contaminanti ambientali possono avere effetti negativi sulla salute riproduttiva di diverse specie animali (Colborn et al., 1993; Vos et al., 2000). Fra i contaminanti, gli ftalati destano particolare interesse a causa del loro ampio impiego come plastificanti nella manifattura di prodotti di uso comune (es. giocattoli per l¿infanzia, contenitori alimentari e attrezzature biomediche) e della loro capacità di interferire con l¿equilibrio endocrino (Latini et al., 2004). Fra gli ftalati, il di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) è il più utilizzato ed è stato dimostrato indurre tossicità riproduttiva nei roditori. In particolare, in ratti femmine sono state osservate: ridotta fertilità, anomalie morfologiche dell¿ovaio, mancata ovulazione e alterata steroidogenesi (Lovekamp-Swan et al., 2004). Il DEHP viene metabolizzato a mono(2-ethylhexyl)phthalate (MEHP), che presenta effetti negativi sulla riproduzione simili a quelli riscontrati per il DEHP, ma a dosaggi inferiori.
In base a queste informazioni appare evidente che l¿ovaio è un organo bersaglio per DEHP/MEHP. Tuttavia, le informazioni riguardanti gli effetti di questi composti sulla maturazione dell¿ovocita e lo sviluppo embrionale negli animali domestici sono attualmente scarse.
Scopo del progetto è di analizzare gli effetti del DEHP e del MEHP durante la maturazione degli ovociti, la fecondazione e lo sviluppo embrionale nella specie suina. Inoltre, gli effetti di modulazione dell¿attività endocrina saranno analizzati nelle cellule follicolari.
Complessi cumulo-ovocita (COCs) e cellule follicolari saranno prelevati da ovaie suine ottenute in sede di macellazione. I COCs verranno maturati e fecondati in vitro e i risultanti embrioni saranno coltivati fino allo stadio di blastocisti, in presenza o assenza di diverse quantità di DEHP e MEHP, allo scopo di determinare la minima dose efficace. Quali parametri di valutazione saranno analizzati la maturazione nucleare degli ovociti, la vitalità e il grado di apoptosi delle cellule del cumulo, la percentuale di embrioni in grado di sostenere la prima divisione mitotica e il numero delle blastocisti. Per le blastocisti verrà inoltre analizzato il numero delle cellule, il rapporto trofoectoderma/nodulo embrionale e il grado di apoptosi. In COCs e embrioni a diversi stadi di sviluppo sarà, inoltre, analizzata l¿espressione di un pannello di geni legati alla qualità dell¿ovocita e delle cellule del cumulo (GDF-9, BMP-15, c-Kit, Kit-L, COX2 e HAS2) e dell¿embrione (es. Bax, Cx43, LIF and LIF-R).
Parallelamente, colture primarie di cellule della teca interna e della granulosa murale verranno sottoposte a trattamento con diluizioni seriali di DEHP e MEHP. Al termine della coltura i campioni saranno analizzati per la proliferazione e vitalità cellulare e per l¿incidenza dell¿apoptosi. Inoltre verrà studiata l¿espressione genica e proteica di molecole legate alla funzionalità endocrina (es. ER alpha e beta, LH-R, FSH-R, PR).