Determinazione dell¿espressione di citochine in monociti bovini stimolati con Neospora caninum.
Progetto Neospora caninum è un protozoo appartenente al phylum Apicomplexa che infetta il bovino e il cane, l¿unico ospite definitivo ad oggi accertato. In tempi recenti sono stati ottenuti diversi isolati di N. caninum; nonostante ciò, le informazioni riguardo la variabilità genetica tra i diversi isolati sono comunque limitate e in corso di studio da parte del presente gruppo di ricerca. A questo riguardo ci si può riferire a quanto noto riguardo a Toxoplasma gondii, parassita strettamente correlato a N. caninum, la cui diversità genetica viene ritenuta responsabile delle variabilità di virulenza, di differenti risposte immunitarie; lo studio di questi aspetti è considerato estremamente utile per la definizione dell¿epidemiologia del parassita. Infatti, la relazione fra i genotipi di T. gondii e alcune caratteristiche biologiche è ora chiaramente stabilita. Il genotipo I di T. gondi (basato sui polimorfismi di antigeni di superficie) è, per esempio, considerato altamente virulento e causa morte nei topi, mentre il genotipo II è meno patogenetico ed è normalmente riscontrato nelle infezioni croniche asintomatiche. Il genotipo del ceppo influenza inoltre la risposta immunitaria dell¿ospite: è stata riportata una sovrainduzione di citochine pro-infiammatorie durante l¿infezione da parte del genotipo I, mentre una produzione controllata delle medesime citochine ha un effetto protettivo dopo l¿infezione da parte del genotipo II. In questo progetto ci si prefigge di valutare il pattern differenziale di espressione di citochine pro-infiammatorie da parte di cellule del sistema immunitario bovino stimolate con isolati differenti di N. caninum dopo genotipizzazione e con antigeni di superficie del parassita prodotti in forma ricombinante. I monociti isolati da sangue periferico di bovini sani e sieropositivi sani verranno quindi stimolati con antigeni solubili di N. caninum appartenenti a genotipi differenti o con antigeni immunomodulatori di superficie, espressi in forma ricombinante, che siano polimorfici fra differenti genotipi del parassita e quindi utilizzabili come markers di variabilità. L¿RNA delle cellule stimolate verrà estratto mediante l¿utilizzo di kit commerciali e retrotrascritto a cDNA. Si procederà con la messa a punto di PCR semiquantitative o PCR Real-Time per la valutazione dell¿espressione di citochine immunomodulatorie quali IL-12, IFN-¿, IL-4 e TNF-alfa. La valutazione del livello di espressione relativa delle citochine prodotte dalle cellule stimolate è resa possibile mediante il calcolo del delta-delta Ct. Tale calcolo verrà effettuato dopo normalizzazione dei cDNA con gene housekeeping, ossia un gene la cui espressione in quel particolare tipo cellulare è ritenuta stabile ed indipendente dalle condizioni sperimentali. Per il monitoraggio dell¿amplificazione ai fini del presente progetto si prenderanno in considerazione il sistema di detection tramite SYBR-Green.