Funzione delle proteine del locus UL131-128 del citomegalovirus umano come determinanti essenziali del tropismo del virus

Introduzione Il citomegalovirus umano (HCMV) e' uno dei maggiori opportunisti negli stati di incompetenza immunitaria: infetta diversi tipi cellulari, tra cui cellule endoteliali, che sono il principale sito di proliferazione e diffusione virale. Infetta inoltre monociti, cellule dendritiche, cellule epiteliali retiniche e polmonari. I tre geni contigui UL131-128 sono stati da noi caratterizzati come determinanti essenziali del tropismo di HCMV per le cellule endoteliali. Il locus codifica tre proteine di natura secretoria. Abbiamo inoltre dimostrato che pUL130 e pUL128 sono componenti del virione. Scopo della ricerca e' la definizione del ruolo delle proteine del locus nel generare virioni endoteliotropici. L'approfondimento di questi aspetti potrebbe fornire informazioni utili per lo sviluppo di farmaci inibitori dell'ingresso di HCMV in cellule importanti per la patogernesi. La caratterizzazione di proteine virali importanti nelle fasi iniziali del ciclo infettivo è fondamentale per lo sviluppo di vaccini. Obiettivi Specifici 1) Definizione del blocco presente nei ceppi virali difettivi durante la penetrazione di HCMV in cellule endoteliali. 2) Espressione e purificazione di versioni ricombinanti delle proteine del locus per la generazione di anticorpi e per saggi di co-purificazione. 3) Utilizzo degli anticorpi prodotti per la verifica della presenza di pUL131 sui virioni e per saggi di coimmunopurificazione, al fine di definire i complessi di cui le tre proteine fanno parte. 4)Ricerca di recettori cellulari mediante cross-llinking con versioni ricombinanti delle tre proteine pUL128, UL130 e pUL131. Materiali e metodi Western blotting, immunoprecipitazione ed immunofluorescenza con anticorpi specifici; sistema a doppio ibrido in lievito. Un sistema di knock-out/knock-in di bac-midi per creare ceppi di HCMV con mutazioni puntiformi in UL131-128. Il trasporto di chimere proteina virale-GFP verra' studiato mediante microscopia confocale