I canali ionici sono proteine trasmembrana che mediano il passaggio degli ioni attraverso la membrana. I canali ionici sono in genere selettivi e favoriscono il passaggio di una sola specie ionica, distinguendola da altre molto simili per dimensioni e carica. I canali per il potassio ad esempio possono essere 100.000 volte più selettivi per il K+ rispetto allo ione Na+. La regione centrale del canale del potassio è detta ¿filtro di selettività¿ e consiste in una serie di quattro siti di legame (S1-S4) che riconoscono e coordinano gli ioni potassio in transito fra l¿esterno e l¿interno della cellula. Mutazioni nel fitro di selettività producono in genere canali che non funzionano o con alterazioni di conduttanza e gating. Nel nostro modello sperimentale, il canale per il potassio Kcv, abbiamo identificato una mutazione nel residuo T63 del fitro che porta alla scomparsa di un fenomeno comunemente osservato nei canali del potassio: il blocco della corrente da parte dello ione Ba++ aggiunto alla soluzione esterna. L¿analisi elettrofisiologica effettuata sulle macrocorrenti ha messo in luce che nel mutante T63S la Kd per il bario aumenta di 100 volte rispetto al WT (Kd WT = 7 µM, Kd T63S = 700 µM). Il modello di Kcv costruito per omologia con i canali cristallizzati mostra che la treonina T63 contribuisce a formare il sito di legame più interno, S4. Lo ione Ba++, che ha dimensioni simili al K+, sarebbe così in grado di transitare dai siti S1-S3, rimanendo però intrappolato nel sito S4, probabilmente per via della sua carica doppia rispetto al K+, bloccando il transito degli ioni K+. La mutazione conservativa T63S porta alla scomparsa di un gruppo metile con conseguenti modifiche steriche ma non elettrostatiche rendendo pertanto non intuitiva l¿interpretazione del suo effetto. In questo progetto proponiamo di effettuare misure di singolo canale sulla proteina mutante T63S allo scopo di analizzare più in dettaglio l¿effetto della mutazione. La tecnica di misura e di analisi del singolo canale Kcv ci consentirà di definire se e quali proprietà del canale siano alterate dalla mutazione. Se ad esempio si verificasse una modifica della conduttanza del canale al K+, questo confermerebbe il contributo della posizione 63 nella formazione del sito di binding S4. Inoltre gli esprimenti di misura di singolo canale verranno effettuati in configurazione ¿inside-out¿ che permetterà di accedere al canale dal lato citosolico. In questa configurazione sarà possibile verificare se ioni con dimensioni e/o cariche diverse dal bario siano ugualmente esclusi dal sito S4 del mutante.