INTERAZIONE STRUTTURALE E FUNZIONALE DI RESIDUI CHIAVE PER L¿ATTIVITA¿ DEL COTRASPORTATORE DI AMMINOACIDI KAAT1.
Progetto Il presente progetto di ricerca intende proseguire l¿analisi struttura/funzione del cotrasportatore di amino acidi neutri KAAT1, clonato dall¿intestino di lepidottero (Castagna et al., PNAS, 95: 5395-5400, 1998).
KAAT1 appartiene alla super famiglia dei trasportatori NSS che comprende, oltre a molti trasportatori di neurotrasmettitori, anche diversi trasportatori di amino acidi. KAAT1 è l¿unico membro della famiglia, assieme ad un altro trasportatore isolato da insetto, CAATCH1, in grado di essere attivato da Na+, da K+ ed in misura minore, da Li+.
Recentemente, grazie all¿analisi comparata della struttura primaria e secondaria di KAAT1 e di CAATCH1 con quella degli altri membri della famiglia, è stato possibile determinare il ruolo svolto dal residuo D338 nella selettività ionica e nell¿accoppiamento del flusso di amino acido e del catione che caratterizzano l¿attività di trasporto di KAAT1 (Mari et al.,CMLS, 61: 243-256, 2004). Con lo stesso tipo di approccio intendiamo ora individuare altri residui specifici di KAAT1 e CAATCH1 che possano concorrere a determinare la peculiare selettività ionica del cotrasportatore. Ci concentreremo sui residui carichi positivamente, presenti sia in KAAT1 che in CAATCH1, ma non conservati nell¿ambito della famiglia che potrebbero avere un¿interazione di tipo polare con il residuo D338. Verranno prodotti dei mutanti la cui attività verrà testata mediante espressione in oociti di Xenopus laevis e con tecniche radioisotopiche, biochimiche ed elettrofisiologiche. I dati raccolti potrebbero fornirci anche delle indicazioni sull¿organizzazione tridimensionale del cotrasportatore. Queste informazioni potranno poi essere confrontate con quelle fornite dalla prima struttura tridimensionale pubblicata per un membro della famiglia NSS, il trasportatore batterico LeuTAa, che ha una omologia del 22% con KAAT1.