ESPANSIONE DI CELLULE POSITIVE PER IL FATTORE DI TRASCRIZIONE DI INSULINA (PDX-1 ) DA SANGUE DI CORDONE OMBELICALE UMANO
ProgettoPRESUPPOSTI
Il sangue di cordone ombelicale umano contiene cellule staminali in grado di originare tutte le componenti cellulari mature del sangue (HSC) e Multipotent Adult Progenitor cells(MAPCs) capaci di differenziare in tipologie cellulari quali osso, cartilagine, adipociti , cellule epatiche , cellule muscolari ed altre ancora (Reyes M & Verfaille CM,Ann N.Y.Acad Sci,938,2001; Kogler G. et al.,J.Exp.Med 200:123-135, 2004). Nei processi di proliferazione-differenziazione intervengono numerosi fattori di trascrizione attivi nel reclutamento e nel mantenimento del programma di espressione di geni linea-specifici ( Gribaldo L. et al., Exp. Hematol. 30: 628,2002) che sono importanti da indagare .
DESCRIZIONE ED OBIETTIVO
Precedenti esperimenti hanno evidenziato , nel sangue di cordone ombelicale, cellule che esprimono markers comei nestina e citocheratina 8 e 18 e fattori di trascrizione come Isl-1, Pax-4 e Ngn-3 importanti nella differenziazione pancreatica suggerendo che potrebbe trattarsi di cellule con fenotipo simile a quello dei precursori di transizione di cellule endocrine verso la differenziazione beta- cellulare ( Pessina et al. Biochem .Biophys. Res. Comm. 323:315-322,2004).
Il sangue di cordone ombelicale ( ancora inutilizzato al 50% ) rappresenta una importante fonte di staminali che potrebbe anche costituire una valida risorsa in tutti quei nei tentativi di ricostruzione anatomo-funzionale di tessuti ed organi danneggiati.
La nostra ricerca si propone di proseguire lo studio iniziato su cellule mononucleate isolate da sangue di cordone ombelicale per
1 Individuare le condizioni di coltura in vitro per espandere le cellule positive per il fattore di trascrizione dell¿insulina PDX-1.
2-Caratterizzare le cellule PDX-1+ nei riguardi della espressione di altri geni importanti nella differenziazione beta cellulare ( Glut-2; Pax-4; Nkx6.1 Ngn-3)
3 Studiare le condizioni per indirizzarne la differenziazione verso la tipologia beta-cellulare in grado di produrre insulina .
Per tale ricerca saranno applicate : a)metodologie di separazione su gradiente, di cellule mononucleate da sangue di cordone ombelicale e di successiva coltura sia liquida che in mezzo semisolido ( metilcellullosa); b) tecniche di RT-PCR e di western blotting per studiare l¿espressione di mRNA e la produzione di proteine; c) tecniche di immunocitochimica per identificare le popolazioni cellulari con fenotipo PDX-1 +.
Il sangue di cordone ombelicale umano contiene cellule staminali in grado di originare tutte le componenti cellulari mature del sangue (HSC) e Multipotent Adult Progenitor cells(MAPCs) capaci di differenziare in tipologie cellulari quali osso, cartilagine, adipociti , cellule epatiche , cellule muscolari ed altre ancora (Reyes M & Verfaille CM,Ann N.Y.Acad Sci,938,2001; Kogler G. et al.,J.Exp.Med 200:123-135, 2004). Nei processi di proliferazione-differenziazione intervengono numerosi fattori di trascrizione attivi nel reclutamento e nel mantenimento del programma di espressione di geni linea-specifici ( Gribaldo L. et al., Exp. Hematol. 30: 628,2002) che sono importanti da indagare .
DESCRIZIONE ED OBIETTIVO
Precedenti esperimenti hanno evidenziato , nel sangue di cordone ombelicale, cellule che esprimono markers comei nestina e citocheratina 8 e 18 e fattori di trascrizione come Isl-1, Pax-4 e Ngn-3 importanti nella differenziazione pancreatica suggerendo che potrebbe trattarsi di cellule con fenotipo simile a quello dei precursori di transizione di cellule endocrine verso la differenziazione beta- cellulare ( Pessina et al. Biochem .Biophys. Res. Comm. 323:315-322,2004).
Il sangue di cordone ombelicale ( ancora inutilizzato al 50% ) rappresenta una importante fonte di staminali che potrebbe anche costituire una valida risorsa in tutti quei nei tentativi di ricostruzione anatomo-funzionale di tessuti ed organi danneggiati.
La nostra ricerca si propone di proseguire lo studio iniziato su cellule mononucleate isolate da sangue di cordone ombelicale per
1 Individuare le condizioni di coltura in vitro per espandere le cellule positive per il fattore di trascrizione dell¿insulina PDX-1.
2-Caratterizzare le cellule PDX-1+ nei riguardi della espressione di altri geni importanti nella differenziazione beta cellulare ( Glut-2; Pax-4; Nkx6.1 Ngn-3)
3 Studiare le condizioni per indirizzarne la differenziazione verso la tipologia beta-cellulare in grado di produrre insulina .
Per tale ricerca saranno applicate : a)metodologie di separazione su gradiente, di cellule mononucleate da sangue di cordone ombelicale e di successiva coltura sia liquida che in mezzo semisolido ( metilcellullosa); b) tecniche di RT-PCR e di western blotting per studiare l¿espressione di mRNA e la produzione di proteine; c) tecniche di immunocitochimica per identificare le popolazioni cellulari con fenotipo PDX-1 +.