PPARgamma ha un ruolo principe nel differenziamento adipocitario. Dato che EDF-1 è un coattivatore trascrizionale di PPAR¿, si studierà:
1- Espressione di EDF-1 nel differenziamento adipocitario. Alla luce di dati preliminari, si ipotizza un¿azione concertata tra EDF-1 e PPAR¿ nella regolazione del differenziamento di 3T3-L1 in adipociti. Per comprendere il ruolo di EDF-1 in questo processo, si inibirà l¿espressione di EDF-1 con siRNA. Le 3T3-L1 saranno trasfettate con siRNA e, in parallelo, verrà indotto il differenziamento aggiungendo al medium di coltura insulina, isobutilmetilxantina e desametazone. A distanza di 6 giorni, si visualizzerà e quantificherà l¿accumulo di lipidi con Oil Red O in cellule trasfettate o meno con siRNA anti-EDF-1.
2- Analisi dell¿attivazione trascrizionale mediata da EDF-1 e PPAR¿. Ci proponiamo di comprendere se EDF-1 è implicato nell¿attivazione di promotori PPAR¿-dipendenti. A tale fine, trasfetteremo le 3T3-L1 con un plasmide contenente la luciferasi come gene reporter sotto il controllo di un promotore artificiale ottenuto per fusione di 4 sequenze consensus per PPAR¿. Indurremo quindi il differenziamento come descritto sopra e analizzeremo l¿attivazione trascrizionale PPAR¿-dipendente a diversi tempi dall¿inizio del differenziamento, misurando l¿attività luciferasica. Questi esperimenti saranno condotti anche in 3T3-L1 trasfettate con siRNA anti-EDF-1 e relativi controlli.
3- Analisi del profilo di espressione genica in cellule 3T3-L1 che non esprimono EDF-1. Ci proponiamo di identificare i geni attivati in modo EDF-1 dipendente nel corso del differenziamento adipocitario. Utilizzeremo i microarray in 3T3-L1 controllo vs quelle trasfettate con siRNA anti-EDF-1. I geni differenzialmente espressi saranno analizzati mediante Real-Time-PCR per confermare i risultati del microarray. L¿identificazione di geni modulati da EDF-1 ci darà importanti informazioni circa la specificità di questo coattivatore trascrizionale.