Meccanismi molecolari alla base dell'inibizione dell'attività infiammatoria della Trombina da parte di C1-INH. Studio in vitro.
Progetto La trombina (TR) gioca un ruolo importante nei processi infiammatori associati alle malattie neurodegenerative come la Malattia di Alzheimer. TR attiva la glia, gli astrociti e i neuroni, induce vasopermeabilizzazione, digerisce il precursore dell'amiloide (APP) generando frammenti di A-beta neurotossici. In circolo il principale inibitore della trombina è l¿anti-TR III, poco si sa invece del meccanismo di controllo a livello della parete vascolare dove si ipotizza un ruolo chiave di C1-INH.
Scopo del lavoro: 1) valutare il ruolo di C1-INH legato alla membrana di cellule endoteliali umane in vitro (HUVEC) nella regolazione dell¿attività di TR, incluse vasopermeabilizzazione e produzione di Amiloide; 2) Identificare i meccanismi molecolari alla base di tale attività.
Approccio metodologico
1. Espressione di C1-INH ricombinate (rC1-INH) in Picchia pastoris. Si utilizzera il vettore pPICZaA, costruito per l¿esperessione in Picchia pastoris e la secrezione della proteina target nel supernatante. Mutazioni verranno inserite nel gene di C1-INH mediante PCR.
2. Inibizione dell¿attività di TR da parte di C1-INH e rC1-INH legati alle HUVEC. HUVEC saranno esposte a C1-INH e rC1-INH e, dopo lavaggio, a ¿-trombina; la capacità di inibire la TR da C1-INH legato alle HUVEC sarà valutata utilizzando substrato cromogenico.
3. Legame di C1-INH e rC1-INH alle HUVEC. Si utilizzarà una tecniche di immunoistochimica.
4. Test di permeabilizzazione endoteliale. HUVEC a confluenza in apposite camere e trattate con C1-INH o rC1-INH, saranno esposte a ¿-trombina e si valuterà il passaggio attraverso il monolayer di tracciante perossidato.
5. Inibizione del rilascio di APP indotto dalle trombina. HUVEC a confluenza saranno trattate con C1-INH o rC1-INH, e quindi con a ¿-trombina. A tempi diversi di incubazione il sopranatante sarà raccolto e frazionato mediante SDS-PAGE. La produzione di APP sarà determinata mediante wester-blott e immunovisualizzazione con mo-Ab anti APP perossidato.