Piattaforma di biotecnologie verdi e di tecniche gestionali per un sistema agricolo ad elevata sostenibilita' ambientale
Progetto L’attività sperimentale, prevalentemente condotta da UNIMI-Ingegneria molecolare di proteine vegetali (Dr Alessio Scarafoni) in una prima fase sarà così articolata:
a) identificazione delle linee di mais oggetto di studio – in collaborazione con Dr Roberto Pilu (e CRA-MAC) verranno scelte più linee di mais tra quelle più comunemente utilizzate nei programmi di miglioramento genetico;
b) messa a punto delle condizioni sperimentali volte all’ottenimento, in funzione delle diverse linee utilizzate, di di peptidi e proteine rilasciati dal seme nelle mezzo di germinazione;
c) purificazione della frazione proteica da altri composti (polisaccaridi e molecole organiche a basso peso molecolare) mediante tecniche biochimiche separative tradizionali (come ad esempio precipitazioni selettive e procedure cromatografiche) e/o mediante ultrafiltrazione; la purificazione è necessaria per eliminare possibili interferenze durante l’esecuzione delle successive attività sperimentali volte alla caratterizzazione quantitativa e qualitativa del materiale proteico ottenuto;
d) analisi quantitativa dei peptidi e delle proteine rilasciate nel mezzo - i peptidi e le proteine isolate verranno quantificate mediante metodo colorimetrici; tale quantificazione permetterà anche di determinare la cinetica di rilascio del materiale proteico durante le prime fasi della germinazione;
e) test di attività biologica delle miscele peptiche – le miscele peptidiche ottenute dalle diverse linee saranno saggiate, in collaborazione con UNIMI- Micotossicologia e lotta ai funghi patogeni per la loro attività biocida nei confronti di specie fungine edafiche potenzialmente patogene per le piante.
L’attività proseguirà in una seconda fase volta alla caratterizzazione delle proteine e dei peptidi isolati durante il primo anno. Tale fase consisterà: a) nell’analisi qualitativa delle proteine rilasciate mediante approcci di tipo proteomico; si ricorrerà, quindi, a tecniche elettroforetiche monodimensionale e bidimensionali (essenzialmente IEF/SDS-PAGE, ma non si esclude l’adozione di altre tecniche elettroforetiche per la risoluzione di miscele proteiche complesse); le mappe elettroforetiche ottenute verranno analizzate mediante software specifico per la quantificazione di ogni singola proteina separata; tra tutte le proteine verranno selezionate per la successiva sperimentazione quelle rilasciate dal seme in maggiore quantità nel mezzo di germinazione e quelle che mostreranno significativi fenomeni di modulazione del loro rilascio in funzione del tempo; queste proteine verranno quindi identificate mediante spettrometria di massa ed tecniche di bioinformatica; b) saggi biologici in vivo –a seguito dell’attività sperimentale descritta nel punto precedente, gli eventuali peptidi o proteine purificate considerate di maggiore interesse saranno saggiate, in collaborazione con UNIMI-Micotossicologia e lotta ai funghi patogeni per le loro attività biocida nei confronti di specie fungine edafiche potenzialmente patogene per le piante.