Determinanti della polarità cellulare: ruolo degli stimoli polarizzanti extracellulari nell'attivazione e mantenimento di programmi genetici e funzionali in organismi multicellulari
Progetto La divisione asimmetrica delle cellule e l’assegnazione disuguale/disomogenea del loro contenuto è essenziale per uno sviluppo corretto. Questo processo di segregazione attiva è poco compreso ma in molti casi si e’ dimostrato dipendere dal citoscheletro. “Motor proteins” che si muovono lungo i filamenti di actina e i microtubuli sono i candidati ideali per fornire il movimento necessario per suddividere il contenuto della cellula in un modo asimmetrico. Il ruolo delle miosine in tali processi è stato suggerito, ma pochi esempi del loro coinvolgimento sono noti.
La miosina VI è stata studiata per la prima volta in Drosophila, dove è stato vista partecipare alla migrazione cellulare durante lo sviluppo delle ovaie, nella spermatogenesi e nella divisione asimmetrica dei neuroblasti. La miosina VI si muove attraverso l’estremità negativa “pointed end” dei filamenti di actina, una direzione distinta da tutti gli altri membri della famiglia, che si muovono verso l’estremità positiva. La miosina VI è stata localizzata a livello del complesso di Golgi, nei “ruffles” di membrana e nelle invaginazioni rivestite di clatrina della membrana plasmatica. Dati recenti suggeriscono che la miosina VI ha un ruolo sia nel trasporto delle vescicole endocitiche che nella protrusione della membrana cellulare, lungo i filamenti polarizzati dell’actina. E’ ipotizzabile che il collegamento tra i compartimenti endocitici, la proliferazione e la migrazione cellulare avvenga attraverso la regolazione della polarità epiteliale. Sara’ interessante capire se questi compartimenti sono connessi attraverso la miosina VI o se questa proteina assume ruoli separati nella regolazione dell’endocitosi, della polarità cellulare e della migrazione cellulare.
Nonostante l’interesse crescente, ad oggi si sa poco dei meccanismi molecolari che regolano l’azione della miosina VI. Dati preliminari del nostro laboratorio hanno rivelato la presenza di due domini di legame all’ ubiquitina (UBDs) nella porzione del C-terminale di miosina VI, posizionati nella coda C-terminale della molecola: il primo dominio, MIU (motif interacting with ubiquitin) era gia’ stato identificato dal nostro gruppo nella proteina Rabex-5 ed e’ stato identificato grazie ad un’analisi bioinformatica, il secondo chiamato da noi NBD (novel binding domain) di circa 60 aminoacidi con una predizione di struttura secondaria ad alfa elica. E’ interessante notare che la miosina VI presenta diverse isoforme in cui la porzione variabile, definita come “inserto grande”, si colloca proprio tra i due domini UBDs.
In seguito a queste osservazioni, in questo progetto intendiamo esaminare il ruolo della miosina VI nella polarità cellulare e nella migrazione cellulare con particolare attenzione al possibile ruolo funzionale esercitato da questi UBDs. In linea con la conoscenza attuale, la nostra ipotesi è che il legame all’ ubiquitina possa assistere la dimerizzazione della coda della miosina VI e quindi contribuire alla migrazione cellulare / polarità cellulare migliorando il trasporto progressivo di molecole/vescicole lungo i filamenti di actina. In alternativa, gli UBDs della miosina VI potrebbero servire come siti di attracco per il reclutamento di “cargos” ubiquitinate, sotto il controllo di una rete di segnalazione più complessa. A questo scopo ci aspettiamo di ottenere preziose informazioni dalla caratterizzazione degli interattori cellulari ubiquitinati che abbiamo già identificato attraverso spettrometria di massa. Caratterizzeremo i principi organizzativi del complesso miosina VI:Ub e valuteremo eventuali fenotipi di migrazione cellulare/ polarizzazione in cellule dove la miosina VI endogena è stata sostituita con mutanti incapaci di legare l’ubiquitina. In sostanza, ci proponiamo di usare un approccio multidisciplinare che coinvolge la biologia cellulare e strutturale
La miosina VI è stata studiata per la prima volta in Drosophila, dove è stato vista partecipare alla migrazione cellulare durante lo sviluppo delle ovaie, nella spermatogenesi e nella divisione asimmetrica dei neuroblasti. La miosina VI si muove attraverso l’estremità negativa “pointed end” dei filamenti di actina, una direzione distinta da tutti gli altri membri della famiglia, che si muovono verso l’estremità positiva. La miosina VI è stata localizzata a livello del complesso di Golgi, nei “ruffles” di membrana e nelle invaginazioni rivestite di clatrina della membrana plasmatica. Dati recenti suggeriscono che la miosina VI ha un ruolo sia nel trasporto delle vescicole endocitiche che nella protrusione della membrana cellulare, lungo i filamenti polarizzati dell’actina. E’ ipotizzabile che il collegamento tra i compartimenti endocitici, la proliferazione e la migrazione cellulare avvenga attraverso la regolazione della polarità epiteliale. Sara’ interessante capire se questi compartimenti sono connessi attraverso la miosina VI o se questa proteina assume ruoli separati nella regolazione dell’endocitosi, della polarità cellulare e della migrazione cellulare.
Nonostante l’interesse crescente, ad oggi si sa poco dei meccanismi molecolari che regolano l’azione della miosina VI. Dati preliminari del nostro laboratorio hanno rivelato la presenza di due domini di legame all’ ubiquitina (UBDs) nella porzione del C-terminale di miosina VI, posizionati nella coda C-terminale della molecola: il primo dominio, MIU (motif interacting with ubiquitin) era gia’ stato identificato dal nostro gruppo nella proteina Rabex-5 ed e’ stato identificato grazie ad un’analisi bioinformatica, il secondo chiamato da noi NBD (novel binding domain) di circa 60 aminoacidi con una predizione di struttura secondaria ad alfa elica. E’ interessante notare che la miosina VI presenta diverse isoforme in cui la porzione variabile, definita come “inserto grande”, si colloca proprio tra i due domini UBDs.
In seguito a queste osservazioni, in questo progetto intendiamo esaminare il ruolo della miosina VI nella polarità cellulare e nella migrazione cellulare con particolare attenzione al possibile ruolo funzionale esercitato da questi UBDs. In linea con la conoscenza attuale, la nostra ipotesi è che il legame all’ ubiquitina possa assistere la dimerizzazione della coda della miosina VI e quindi contribuire alla migrazione cellulare / polarità cellulare migliorando il trasporto progressivo di molecole/vescicole lungo i filamenti di actina. In alternativa, gli UBDs della miosina VI potrebbero servire come siti di attracco per il reclutamento di “cargos” ubiquitinate, sotto il controllo di una rete di segnalazione più complessa. A questo scopo ci aspettiamo di ottenere preziose informazioni dalla caratterizzazione degli interattori cellulari ubiquitinati che abbiamo già identificato attraverso spettrometria di massa. Caratterizzeremo i principi organizzativi del complesso miosina VI:Ub e valuteremo eventuali fenotipi di migrazione cellulare/ polarizzazione in cellule dove la miosina VI endogena è stata sostituita con mutanti incapaci di legare l’ubiquitina. In sostanza, ci proponiamo di usare un approccio multidisciplinare che coinvolge la biologia cellulare e strutturale