Tecnologie OMICS e Systems Biology per la definizione di nuove strategie finalizzate al controllo delle infezioni virali
Progetto Introduzione: L’infezione primaria da Polyomavirus umano BK (BKV) è asintomatica ed è seguita dall’instaurarsi di infezione latente nei reni. BKV è l’agente eziologico della Nefropatia Associata ai Polyomavirus (PVAN), che insorge in seguito a trapianto renale, causando la perdita di funzionalità dell’organo nel 45% dei casi. Uno dei fattori di rischio è la terapia immunosoppressiva per prevenire il rigetto. Inoltre, il danno ischemico a cui può essere esposto il rene nel corso del trapianto può contribuire a indurre la riattivazione di BKV. In corso di ipossia, le cellule rispondono attraverso un meccanismo mediato da Hypoxia Inducibile Factor (HIFs), che, in condizioni di normossia, vengono degradati. L’ipossia, invece, inibisce l’ubiquitinazione di HIF, consentendone la traslocazione nel nucleo, dove stimolano la trascrizione di geni target, per preparare la cellula ad affrontare lo stress ipossico.
Alcuni studi hanno dimostrato che specialmente HIF-1α è in grado di influenzare la replicazione di virus, come il polyomavirus JCV, Epstein-Barr Virus e parvovirus B19. Ad oggi, l’esistenza di una possibile interazione tra HIF-1α e BKV non è ancora stata studiata.
Scopo: studio della correlazione tra BKV e HIF-1α, per comprendere i meccanismi molecolari alla base dell’insorgenza della PVAN, in seguito a trapianto renale, e determinare un target molecolare farmacologico.
Metodi: a) Studio degli effetti dell’espressione di HIF-1α sulla trascrizione di BKV: a1) saggi di gene reporter, effettuati con plasmidi contenenti il promotore di BKV a monte rispetto al gene reporter e un plasmide d’espressione del fattore HIF-1α; a2) modello cellulare in vitro: in seguito all’infezione in vitro con BKV, le cellule saranno sottoposte ad ipossia e alla valutazione della replicazione del genoma virale attraverso Quantitative Real Time PCR (Q-PCR) e Western Blot (WB). Nello stesso modello cellulare il fattore HIF-1α verrà silenziato utilizzando la tecnica siRNA e in seguito verrà valutata la replicazione virale.
- Studio dell’esistenza di un legame tra HIF-1α e il promotore di BKV, e tra HIF-1α e altri fattori di trascrizione cellulari: b1) chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay su cellule trasfettate con il vettore di espressione del fattore HIF-1α e un plasmide contenente l’intero genoma di BKV; b2) saggi di gene reporter e co-immunoprecipitazione per valutare l’effetto di altri fattori cellulari di trascrizione sulla replicazione di BKV, quali Smad3/4 e per valutare la cooperazione tra queste proteine e HIF-1α nella regolazione del promotore di BKV; b3) co-immunoprecipitazione seguita da SDS-PAGE e analisi con spettrometro di massa MALDI-TOF, per l’identificazione di proteine sconosciute potenzialmente legate a HIF-1α.
- Studio dell’effetto della replicazione di BKV sul pathway di HIF-1α: c1) infezioni cellulari in vitro con BKV e valutazione dell’espressione di HIF-1α mediante WB; c2) analisi immunoistochimica su biopsie renali di pazienti con PVAN, utilizzando anticorpi diretti sia contro proteine virali, sia contro HIF-1α.
- Studio dei profili proteici di sieri raccolti da pazienti BKV+ con PVAN e da soggetti BKV- senza segni clinici di PVAN, mediante gel 2D e analisi MALDI-TOF delle proteine differenzialmente espresse.