Il fattore trascrizionale p63, omologo di p53, è coinvolto nello sviluppo dei tessuti ectodermici. La sua inattivazione nel topo causa l’assenza completa della cute e degli annessi, e mutazioni con trasmissione dominante nell’uomo causano patologie cutanee e alterazioni agli arti. Il gene p63 contiene due siti di inizio della trascrizione, che danno origine a proteine che contengono –TA- o sono prive –ΔN- di un dominio di transattivazione. Le due isoforme hanno funzioni molto diverse tra di loro. Per comprendere la strategia regolativa di un fattore trascrizionale è necessario conoscere i suoi geni target: il nostro gruppo ha già caratterizzato oltre 1000 target specifici di ΔNp63, tramite esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina su scala genomica (ChIP on chip). Inaspettatamente, tra i geni target di ΔNp63 vi sono geni importanti per lo sviluppo e il differenziamento del cuore.
L’isoforma TA è presente ad alto livello solo nelle cellule Embrionali Staminali (ES) di topo. In studi condotti su cellule ES differenziate in coltura, è emerso che il fattore trascrizionale Sox17, che è espresso nell’endoderma e svolge un ruolo precoce nell’induzione di mesoderma cardiaco, è uno dei target di TAp63.
Il Progetto si svolgerà secondo le seguenti direttrici.
1) Tramite esperimenti di ChIP-Seq, un sistema molto sensibile e preciso di localizzazione genomica grazie a “deep sequencing”, intendiamo identificare i target specifici di TAp63 in cellule ES. Prevediamo l’identificazione di migliaia di target, che saranno comparati con quelli già identificati per ΔNp63 in cheratinociti. I risultati verranno validati e analizzati con sistemi bioinformatici (GO, analisi PSFMs etc.)
2) Intendiamo caratterizzare le cellule ES indirizzate verso un destino cardiaco, tramite inattivazione funzionale e/o overespressione delle isoforme di p63, in termini di espressione di marcatori sotto il controllo di TAp63, identificati precedentemente per ChIP-Seq.
3) Intendiamo utilizzare il sistema modello zebrafish (Danio rerio) per studiare il ruolo dei fattori trascrizionali p63 e Sox17 nello sviluppo cardiaco in vivo. Zebrafish e’ particolarmente adatto allo studio in vivo dello sviluppo cardiovascolare, data la trasparenza degli embrioni e il loro rapido sviluppo, che procede normalmente per alcuni giorni anche in totale assenza di circolazione sanguigna. Questo permette di effettuare in zebrafish manipolazioni genetiche e sperimentali incompatibili con la vitalita’ in altri organismi. Nel nostro laboratorio sono disponibili marcatori molecolari cardiaci e linee transgeniche endoteliali/ematopoietiche, che permettono di analizzare finemente lo sviluppo cardiovascolare in embrioni di zebrafish. La microiniezione di oligonucleotidi antisenso gene-specifici (morfolino) e di mRNA in embrioni di zebrafish ci permettera’ di effettuare saggi di perdita/guadagno di funzione per chiarire l’interplay tra p63 e Sox17 nello sviluppo cardiaco.