ANALISI DELLA VITAMINA K1 (FILLOCHINONE) NEL PLASMA: OTTIMIZZAZIONE DELLA ANALISI HPLC MEDIANTE CONFRONTO CON SPETTROMETRIA DI MASSA E SUO UTILIZZO PER SCREENING EPIDEMIOLOGICI E STUDI CLINICI

PRESUPPOSTI L'apporto nutrizionale di vitamina K e' sostanzialmente diverso non solo tra continenti diversi (America, Europa , Asia) ma anche tra diverse aree geografiche di una stessa nazione, tra sottogruppi di popolazione e tra fasce di eta', in relazione alle piu' o meno corrette abitudini alimentari e ai diversi stili di vita. Stati carenziali conclamati, o a livello subclinico a rischio di slatentizzazione durante l'eta' geriatria o la degenza ospedaliera prolungata, possono aumentare il rischio di patologie a carico sia del sistema vascolare (sanguinamento, calcificazione vascolare) che dell'apparato scheletrico (osteoporosi, osteoatrite,fratture). Informazioni sul ruolo fisiologico e farmacologico della vitamina K, soprattutto a livello della popolazione italiana, sono ancora scarse a causa delle basse concentrazioni della vitamina nel plasma e nei tessuti e delle numerose interferenze e impurezze che possono inficiare la analisi nella matrice biologica. Nel 1° anno di questa ricerca abbiamo messo a punto un metodo per dosaggio della vitamina K1 in HPLC con derivatizzazione post-colonna e rivelazione fluorimetrica. Il metodo e' stato validato per linearita', riproducibilita' e sensibilita'. La accuratezza e' stata valutata in comparazione con altri due metodi HPLC (uno commerciale e uno descritto in letteratura). OBIETTIVI DELLA RICERCA 1. Completare la validazione del metodo HPLC mediante a. partecipazione a esercizi di controllo di qualita' per il dosaggio della vitamina K1 nel plasma organizzati a livello europeo b. comparazione delle performances dell'HPLC con un metodo di piu' alto livello metrologico basato sulla spettrometria di massa con diluizione isotopica. 2. Definire i livelli vitaminici in una popolazione di riferimento opportunamente stratificata per sesso e per eta' 3. Valutare la possibilita' di monitorare anche altri omologhi della vitamina K (menachinone-4 MK-4, vitamina K2, menadione, vitamina K3) METODI Il metodo estrattivo da noi messo a punto verra' applicato al metodo descritto da Suhara Y. et al. (Anal. Chem. 2005, 77, 757-763) basato sull'uso della HPLC-tandem mass-spectrometry (LC-MS/MS). Come standard interno si utilizzera' la vitamina K1 marcata con l'isotopo stabile 18O sintetizzata nel laboratorio di Suhara Y. et al. e gentilmente donataci. Operativamente si utilizzera' la "multiple reaction monitoring" mode (MRM) selezionando uno ione precursore e uno ione figlia mediante tecnica MS/MS. Con il metodo HPLC si partecipera' al programma di Controllo di Qualita' organizzato dal Centre for Haemostasis and Thrombosis, St. Thomas' Hospital, Londra. RISULTATI PREVISTI Determinare accuratamente i livelli di vitamina K1 nel plasma e applicare il metodo a trias clinici in grado di fornire informazioni relative ad effetti terapeutici vitamina K-dipendenti nella prevenzione di osteoporosi, fratture, sanguinamenti soprattutto nella popolazione geriatrica.