Individuazione dei meccanismi di azione della talidomide nel trattamento del mieloma multiplo
Progetto Il Mieloma Multiplo (MM) e¿ una neoplasia del midollo osseo incurabile con le terapie correnti. Le cellule di MM, interagendo con lo stroma del midollo osseo, vengono a trovarsi a stretto contatto con un ambiente ricco di fattori di sopravvivenza che forniscono alle cellule di MM protezione contro gli agenti terapeutici. Nel tentativo di superare questo tipo di resistenza, sono stati ottenuti dei risultati sorprendenti a livello preclinico, con l¿uso della Talidomide (Th). La Th, originariamente utilizzata come sedativo, fu responsabile di malformazioni congenite neonatali (focomelia). Studi recenti hanno dimostrato che la Th possiede una forte azione inibitoria dell¿angiogenesi.
Il gene p63 e¿ un membro della famiglia di p53, il gene oncosoppressore più frequentemente mutato nei tumori umani incluso il MM. Numerose informazioni sulla funzione biologica di p63, sono state ottenute dallo sviluppo di topi KO. Rispetto al ruolo oncosoppressivo di p53, p63 presenta un coinvolgimento nel differenziamento dei tessuti di derivazione ectodermica. Il fenotipo di questi topi e¿ simile a quello di pazienti affetti da displasia ectodermica congenita associate a mutazioni in p63. La somiglianza del fenotipo di questi pazienti con quella dei bambini nati da madri trattate con Th, ci ha spinto a verificare se quest¿ultima avesse una qualche azione su p63. Nostri dati hanno dimostrato che il trattamento con Th porta ad una degradazione specifica di p63, dipendente dal tempo e dalla concentrazione del farmaco: p53 non subisce alterazioni in seguito allo stesso trattamento. L¿iperespressione di p63 è stata correlata con la sopravvivenza cellulare in seguito a trattamenti anti-neoplastici in carcinomi squamosi della testa e collo. Nel loro insieme, questi risultati suggeriscono che la Th possa espletare la sua azione anti-tumorale inibendo l¿azione anti-apoptotica di p63.
Abbiamo individuato una serina e una treonina che, se mutate, determinano la resistenza di p63 alla degradazione indotta dalla Th. Dati preliminari indicano che questi amino acidi possano essere fosforilati dalla chinasi HIPK2 in vitro. HIPK2 e¿ un potente induttore di apoptosi che regola l¿attivazione e i livelli proteici di p53 in seguito a stress genotossico.
Lo scopo di questo progetto consiste nel caratterizzare il meccanismo molecolare con cui la Th porta alla degradazione p63 ed il ruolo di HIPK2.
L¿interazione biochimica tra HIPK2 e p63 sara¿ studiata in vitro con proteine di fusione GST ed in cellule eucariotiche mediante co-immunoprecipitazione. I siti di legame saranno caratterizzati in vitro mediante l¿uso di mutanti di delezione di entrambe le proteine. L¿attivita¿ di HIPK2 su p63 verra¿ studiata con saggi chinasici in vitro e il sito di fosforilazione di p63 individuato mediante l¿uso dei mutanti per delezione. La mappatura fine del/i sito/i di fosforilazione verra¿ condotta con mutanti in cui l¿ipotetica serina o treonina bersaglio di HIPK2 sara¿ stata mutata in alanina