Caratterizzazione delle funzioni imunomodulatorie delle popolazioni monocitarie CD16+ e CD16- nel bovino
Progetto PRESUPPOSTI
I monociti svolgono un ruolo fondamentale durante la infiammazione difendendo l'organismo dagli agenti patogeni ma anche partecipando ai processi risolutivi. I monociti possono quindi comportarsi da cellule sia pro- che anti-infiammatorie. I monociti umani vengono attualmente classificati in almeno due sotto-popolazioni: le cellule CD14++/CD16- ed i CD14+/CD16+ (Porcheray et al., Clin Exp Immunol, 142 : 481, 2005). La seconda popolazione, i CD14+/CD16+, è costituita da cellule comunemente definite monociti pro-infiammatori, sulla base della elevata potenzialità espressiva di citochine pro-infiammatorie, e tende a migrare nel sito della infiammazione a seguito di una stimolazione chemotattica.
Una elevata espressione del CD16 sulla superficie dei monociti conferisce loro alcune caratteristiche, fra cui, per esempio, quella di promuovere la sepsi da E.coli attivando una via metabolica inibitrice della fagocitosi (Pinheiro da Silva, F, et al, Nature Med, 13/11, 1368, 2007).
Dall'equilibrio di queste due popolazioni di monociti deriva una risoluzione ottimale del processo infiammatorio, con la completa clearance della noxa patogena e la restituzione ad integrum del tessuto.
Nessuna informazione per quello che riguarda le sottopopolazioni monocitarie è al momento disponibile nel bovino.
OBIETTIVO DELLA RICERCA
Gli obiettivi di questo progetto sono:
- Caratterizzazione delle sottopopolazioni monocitarie bovine, con lo scopo di valutare se sia possibile classificare anche nel bovino i monociti ematici nelle sue sottopopolazioni CD14++/CD16- ed i CD14+/CD16+.
- Valutazione in vitro della correlazione fra espressione di CD 16 nelle cellule bovine e sepsi da E.coli, come è stato precedentemente osservato nel topo.
DESCRIZIONE DELLA RICERCA
1° fase. Caratterizzazione della cross-reattività degli anticorpi presenti in commercio con cellule ematiche bovine.
Non esiste nel bovino nessuna informazione riguardante la cross-reattività degli anticorpi anti-CD16. La prima parte del lavoro consisterà quindi nella valutazione mediante western blotting della cross-reattività dei cloni degli anticorpi anti-CD16 disponibili sul mercato. Attualmente sono disponibili in commercio circa 10 differenti anticorpi, sia monoclonali che policlonali.
Le cellule verranno purificate mediante sorting magnetico (monociti) o gradiente di densità (polimorfonucleati), seguendo i protocolli messi a punto nel nostro laboratorio (Ceciliani et al., 2007, Vet Immunol Immunopathol 116(3-4):145-52)
2° fase. Caratterizzazione delle sotto-popolazioni monocitarie mediante citometria a flusso.
Una volta individuati gli anticorpi a migliore cross-reattività, la seconda fase del lavoro consisterà nella caratterizzazione delle popolazioni monocitarie mediante tecniche di citometria a flusso: questo studio verrà eseguito utilizzando il citometro a flusso recentemente acquisito dal DIPAV come grande strumentazione.