Studi sulla localizzazione e sulla esocitosi della alfa 1 glicoproteina acida (AGP ) in polimorfonucleati bovini
Progetto L¿alfa1 glicoproteina acida (AGP) è una proteina di fase acuta, espressa principalmente a livello epatico, classificata nella sottofamiglia delle immunocaline, proteine di trasporto di piccole molecole idrofobiche in grado di svolgere anche funzioni immunomodulatorie. Il nostro gruppo ha caratterizzato alcune di queste attività utilizzando come modello sperimentale cellule ematiche bovine: l¿AGP bovina (boAGP) è in grado di agire sui monociti, riducendone sia la chemotassi che la apoptosi. E¿ stato inoltre recentemente dimostrato, in collaborazione con il Dipartimento dell¿Agricultura americano (Dr Bannermann), che la stimolazione di granulociti neutrofili (PMN) con boAGP è in grado di ridurre la produzione di specie reattive dell¿ossigeno (ROS) a livello extracellulare, ma non a livello intracellulare. Questo dato risulta essere particolarmente interessante perché i PMN contengono una isoforma di AGP ricca di fucosio, che nell¿uomo si è rivelata avere una elevata attività anti-infiammatoria.
L¿obiettivo del progetto per cui si richiede il finanziamento è lo studio della localizzazione e della esocitosi della boAGP dai PMN bovini a seguito di stimolazione pro-infiammatoria.
Il progetto si propone due obiettivi:
a) Dimostrare che l¿AGP presente nei granuli viene esportata al di fuori della cellula dopo stimolazione con molecole pro-infiammatorie (PMA, Zymosan) e con molecole in grado di indurre degranulazione (ionomicina). La esocitosi della AGP verrà valutata mediante immunoprecipitazione e WB della proteina nel surnatante, prima e dopo la stimolazione, utilizzando un anticorpo ed un protocollo recentemente pubblicati dal gruppo. Il tempo di degranulazione in cui boAGP appare nel surnatante è correlabile al tipo di granuli in cui boAGP è presente.
b) Valutare mediate RT-PCR (Real Time PCR) se dopo stimolazione i PMN siano in grado di esprimere mRNA codificante per boAGP.
I risultati ottenuti dovrebbero permette di chiarire nel dettaglio molecolare la cinetica della espressione locale della boAGP durante l¿infiammazione. I PMN sono cellule essenziali per lo sviluppo della reazione infiammatoria, ma molto potenti e pericolose se non adeguatamente controllate. Questa ricerca vuole evidenziare se i PMN posseggano all¿interno della cellula molecole in grado di modulare a livello locale la loro attività, in modo tale da controllare gli eventuali danni collaterali prodotti durante la loro attivazione. Dimostrare che boAGP può venire riversata al di fuori dei PMN sarebbe un risultato particolarmente interessante, soprattutto se associato al dato che AGP inibisce i danni da ROS all¿esterno della cellula, ma non all¿interno. La esocitosi dell¿AGP permetterebbe al PMN di sviluppare tutta la propria capacità di generazione dei ROS nel contesto del fagosoma, ma potrebbe al contrario bloccare i danni che la fuoriuscita dei ROS provocano nei tessuti circostanti, per esempio a seguito di fagocitosi incompleta.