RUOLO FISIOPATOLOGICO DI GPR17, UN NUOVO RECETTORE DUALE RESPONSIVO A NUCLEOTIDI URACILICI E A CISTEINIL-LEUCOTRIENI
Progetto I nucleotidi extracellulari (e-) adeninici e uridinici svolgono i loro ruoli fisiopatologici attivando 7 recettori-canale P2X e 8 recettori P2Y a G-proteina. Recentemente, il gruppo della proponente ha identificato un nuovo recettore P2Y (GPR17) responsivo a due diverse famiglie di mediatori infiammatori (nucleotidi uracilici e cisteinil-leucotrieni) e coinvolto nella propagazione del danno ischemico cerebrale (si veda Ciana et al., 2006). Al momento, il laboratorio della proponente ha clonato GPR17 umano e di ratto. La caratterizzazione dell'ortologo murino di GPR17 (a tutt'oggi non identificato), attualmente in corso nel nostro laboratorio, potrà portare alla generazione di animali trasgenici knock-out oppure knock-in, facilitanto notevolmente la definizione completa dei ruoli fisiopatologici di questo recettore. Nell¿ambito della presente richiesta FIRST, intendiamo (i) completare gli studi di caratterizzazione farmacologica del recettore murino e (ii) approfondire il ruolo di GPR17 nel danno neurodegenerativo associato ad ischemia in un modello consolidato di ischemia cerebrale focale indotto dall¿occlusione dell¿arteria cerebrale media (MCAo) nel roditore (sia ratto che topo). Per la caratterizzazione farmacologica, GPR17 murino sarà trasfettato in cellule 1321N1, e l¿espressione del recettore sarà controllata mediante studi di immunocitochimica con un anticorpo sviluppato ad hoc dalla proponente in collaborazione con il CNR di Milano. L¿attivazione del recettore da parte di ligandi cisteinil-leucotrienici e nucleotidici sarà determinata mediante il saggio funzionale del binding del 32-P-GTPgammaS, come precedentemente descritto (Ciana et al., 2006). Il ruolo di GPR17 nella progressione del danno ischemico cerebrale sarà determinato in collaborazione con l¿unità di Risonanza Magnetica Nucleare del Dipartimento, conducendo studi di immunoistochimica su sezioni cerebrali di ratto e topo a vari tempi (24,48, 72 ore e 7 giorni) dopo l¿induzione di ischemia. Su queste sezioni, saranno effettuate immunomarcature con l¿anticorpo anti-recettore e con marcatori specifici per cellule neuronali, astrogliali, oligodendrogliali e microgliali. Questo permetterà di identificare le cellule esprimenti il recettore e le loro alterazioni durante la progressione del danno ischemico. Verificheremo inoltre se le cellule esprimenti GPR17 sono maggiormente suscettibili al danno ischemico mediante co-marcatura con markers di danno cellulare, quali heat shock proteins. L¿eventuale contributo alla propagazione del danno da parte delle cellule circolanti del sangue (macrofagi in particolare), che penetrano nel cervello in seguito alla permeabilizzazione della barriera ematoencefalica, sarà determinato conducendo in parallelo studi di immunomarcatura con markers specifici per queste cellule. Tutte le analisi immunoistochimiche saranno effettuate al microscopio a fluorescenza oppure al confocale.