Valutazione epigenetica del centro di regolazione dell'imprinting ICR2 (11p15) nelle placente di gravidanze con iposviluppo fetale
Progetto Razionale
Nella regione cromosomica 11p15 è localizzato un cluster di geni imprinted, le cui funzioni sono connesse con la crescita e lo sviluppo fetale e post-natale. Tra questi, IGF2 e KCNQ10T1, con imprinting materno, promuovono la crescita intrauterina; mentre CDKN1C e H19, ad imprinting paterno, agiscono come soppressori della crescita. L¿espressione differenziale di questo cluster di geni è coordinata da 2 loci di regolazione: ICR1 regola l¿espressione di IGF2 e H19, ICR2 quella di CDKN1C, KCNQ10T1e altri loci. La Sindrome di Beckwith-Wiedemann (BWS,OMIM:130650), caratterizzata da un¿iper-crescita pre- e post-natale, è associata ad alterazioni genetiche ed epigenetiche della regione 11p15. Recentemente, allo stesso locus sono state riscontrate epimutazioni in soggetti affetti da Sindrome di Silver-Russel (SRS, OMIM: 180860), caratterizzata da severa riduzione della crescita intrauterina (IUGR) e post-natale. Il gene IGF2 è uno dei principali regolatori positivi della crescita intrauterina. E¿ espresso anche nella placenta dove agisce promuovendo il trasferimento di nutrienti dalla madre al feto. Benché nel topo alterazioni dell¿espressione di Igf2 placentare siano state dimostrate associate a iposviluppo fetale, analoghe evidenze non sono note nell¿uomo. Su questa base razionale è possibile ipotizzare che modificazioni epigenetiche nel locus 11p15, e in particolare a livello dell¿ICR1 nella placenta possano essere associati a IUGR.Ovvero, modificazioni dello stato epigenetico di ICR1 potrebbero determinare alterati pattern di espressione di IGF2 e/o H19, e questo potrebbe determinare alterazioni della crescita intrauterina, mediante un alterato apporto di nutrienti al feto.
METODI
Lo stato di metilazione di ICR1 verrà valutato su una casistica di 30 gravidanze normali e 30 IUGR. Verranno analizzati i DNA da: sangue periferico dei genitori, dei feti e delle placente.. I DNA verranno modificati con NaHSO3 e sottoposti a reazione di amplificazione con primers specifici per la regione di ICR1, già coinvolta nella SRS. I prodotti di PCR verranno digeriti con BstUI, (enzima metilazione-sensibile) e infine analizzati dopo corsa elettroforetica su gel di agarosio. Le bande corrispondenti al prodotto digerito e non digerito verranno quantificate mediante densitometria (Software:Quantity-one). Ciò permetterà di valutare se esiste uno sbilanciamento tra il rapporto allele metilato/non metilato tra soggetti normali e IUGR. Nei casi in cui apparirà evidente uno sbilanciamento verrà effettuato un sequenziamento delle regioni ricche in CpG (metodo Pyrosequencing) per mappare precisamente i siti di metilazione alterati all¿interno della regione regolatoria ICR1.
Obiettivi
Con questo studio ci proponiamo sia di caratterizzare il pattern di metilazione di ICR1 a livello placentare in condizioni di crescita fisiologica, sia di associare lesioni epigenetiche di IGF2/H19 all¿iposviluppo fetale.