STUDIO DELLO STATO DI INATTIVAZIONE DEL CROMOSOMA X IN CELLULE STAMINALI TUMORALI DELLA MAMMELLA

RAZIONALE: Dati recenti della letteratura indicano che la perdita del cromosoma X inattivo (Xi) e la replicazione di quello attivo (Xa) sono eventi frequenti nella tumorigenesi della mammella e mettono in evidenza il ruolo chiave di BRCA1 nella localizzazione dell'RNA di XIST sull'Xi, passaggio indispensabile per l'inattivazione del cromosoma X (XCI). Non è ancora chiaro però l¿esatto ruolo delle anomalie dell'XCI nella tumorigenesi della mammella. Sia i tumori che le linee cellulari tumorali, sono costituiti da una popolazione eterogenea di cellule che include anche le cellule staminali, radice causale del tumore. Verificare lo stato di XCI nelle cellule staminali tumorali della mammella è l¿obiettivo di questo progetto, questo ci permetterà di valutare se cambiamenti genetici ed epigenetici dell¿XCI, siano presenti in queste cellule. La presenza di anomalie dell'XCI nelle cellule staminali indicherebbe che queste alterazioni sono eventi primari nella tumorigenesi della mammella. METODI: Le cellule staminali tumorali, ottenute da linee cellulari di tumore alla mammella e da campioni tumorali, verranno fornite dal laboratorio diretto dalla Dott.ssa Daidone (Istituto Nazionale Tumori Milano), e saranno studiate per lo stato di XCI. Si procederà con i seguenti esperimenti: - valutazione del numero di cromosomi X mediante FISH, analisi del corpo di Barr e genotipizzazione dei cromosomi X utilizzando marcatori polimorfici X-linked. Questo approccio combinato ci permetterà di valutare la presenza di XCI, il numero di cromosomi X e, in assenza di monosomia dell¿X, di determinare l¿eventuale duplicazione dell¿Xa mediante l¿analisi dei marcatori X-linked; - verifica dello stato epigenetico dei promotori di un pannello di geni X-linked normalmente soggetti all¿inattivazione (AR, ZNF261, PGK1, OCRL e POLA). Le regioni del promotore di questi geni saranno analizzate sia per lo stato di metilazione delle isole CpG sia per le modificazioni a livello delle cromatina.