Carbonilazione delle proteine in risposta allo stress cellulare e all’ esposizione a inibitori del ribosoma in Escherichia coli: effetti sulla regolazione dell'espressione genica e formazione del biofilm.

PRESUPPOSTI I microrganismi possono crescere come biofilm (BF), comunità multicellulari adese a superfici solide e racchiuse in una matrice polimerica (EPS). La produzione di fattori di adesione (FA), quali fibre aggregative (curli), cellulosa e poli-N-acetil-glucosamina (PNAG), promuovono la formazione di BF, il quale influisce sulla resistenza agli antimicrobici e può fungere da determinante di virulenza nei batteri patogeni. Regolazione dei FA e formazione di BF rispondono sia allo stress ossidativo (SO) che a concentrazioni subinibitorie di antibiotici mediante meccanismi tuttora non chiari. OBIETTIVI 1) La carbonilazione delle proteine come segnale di formazione del BF. SO e trattamento con concentrazioni subinibitorie di inibitori ribosomali incrementano la formazione di proteine carbonilate (PCO) per modificazione diretta degli amminoacidi nella proteina o per errata incorporazione di amminoacidi nella catena polipeptidica nascente. Noi determineremo i livelli di PCO correlandoli con la formazione di BF. Per verificare se l ’induzione del BF da parte di inibitori ribosomali è mediata da PCO, confronteremo un ceppo WT di E. coli con mutanti in proteine ribosomali a fenotipo “sloppy” (frequente incorporazione di amminoacidi errati durante la sintesi proteica) od a fenotipo iperaccurato. I tre ceppi verranno esposti a streptomicina e determineremo PCO e formazione del BF. Inoltre, verranno esposti a SO inducendo carbonilazione di proteine già sintetizzate (indipendentemente dall’accuratezza ribosomale). Se l’induzione del BF dipende dalla carbonilazione, il trattamento con streptomicina non indurrà formazione di BF nel mutante con iperaccuratezza ribosomale, che invece dovrebbe rispondere allo SO con formazione di BF. 2) Meccanismi di formazione di BF in risposta alla carbonilazione. Per determinare quali FA vengono stimolati dal trattamento con inibitori ribosomali (che possono essere pertanto indotti da elevati livelli di PCO), la stimolazione del BF con concentrazioni subinibitorie di streptomicina verrà effettuata in mutanti incapaci di produrre curli, cellulosa e PNAG, identificando così il FA stimolato dal trattamento con streptomicina. Determineremo inoltre se la stimolazione della produzione di FA streptomicina-dipendente avviene a livello dell’espressione dei geni corrispondenti tramite RT-PCR. Stabilita una correlazione tra PCO e induzione di un particolare FA, investigheremo la trasduzione del segnale da PCO all ’induzione dell’espressione del FA. L’approccio genetico verrà utilizzato per identificare i geni coinvolti nel processo. Disponiamo di una libreria di mutanti di E. coli ottenuta da trasposizione casuale di una cassetta di resistenza alla kanamicina nel cromosoma batterico. La libreria verrà testata in esperimenti di formazione di BF dopo trattamento con streptomicina. L ’approccio genetico fornirà un ’esaustiva correlazione tra PCO, stress, regolazione genica e formazione del BF.