L’azione concertata di chaperoni molecolari e dei sistemi ubiquitina/proteasoma e ubiquitina/endosoma/lisosoma regola il bilanciamento tra acquisizione del corretto folding proteico e degradazione proteica. In particolare, il differenziamento cellulare dipende dalla degradazione finemente regolata, ubiquitina (ub)-dipendente, di molecole segnale, regolative, recettoriali. L’ubiquitinazione di proteine è opera di enzimi noti come Ub-ligasi; il pattern di ubiquitinazione è sotto il controllo di altri enzimi noti come ub-specific-proteasi (UBP) (1). Il pattern di ubiquitinazione rappresenta pertanto il segnale di sorting della proteina e le UBPs sono gli enzimi chiave (2). Nella famiglia delle UBPs, UBPY è evolutivamente conservata; identificata in topo (3) UBPY ha omologhi in uomo, uccelli, anfibi, nematodi e lievito. In vivo UBPY è espressa prevalentemente nelle cellule nervose e germinali maschili (3,4,5) e nel topo il suo KO è letale (6); in sistemi in vitro UBPY regola il sorting endosomale (7) e la sua delezione porta ad aberrazioni sia funzionali che morfologiche delle vescicole del sistema endosoma-lisosoma (8).
L’acrosoma è un vacuolo acido, unico delle cellule germinali maschili; è indispensabile per la fecondazione in quanto spermatozoi privi di acrosoma o con acrosoma anomalo sono infertili. Utilizzando cellule germinali isolate da testicolo di topi wt e mutanti wobbler (maschi infertili) verrà analizzato mediante microscopia confocale il destino di UBPY e, in parallelo, di antigeni marcatori del comparto endosomale e acrosomale. Mediante saggi di interazione proteina-proteina si verificherà con quali proteine UBPY si associa (Berruti).
In Arabidopsis è noto che UBP3/UBP4 intervengono nel processo di gametogenesi e mutanti ubp3/ubp4 producono polline non funzionale, così come mutanti ubp15 hanno fertilità ridotta (9). L’omologo di UBPY nelle piante non è stato ancora caratterizzato. Proponiamo pertanto di indagare sulla presenza/funzione di UBPY/omologhi in organismi vegetali.
Geni omologhi di UBPY saranno caratterizzati sia dal punto di vista molecolare che funzionale (Colombo). Un’indagine cito–istologica verrà effettuato sui mutanti At BPY sia per quanto riguarda la formazione delle spore che dei gametofiti, per individuare a quali stadi è coinvolta proteina UBPY (Spada). Da queste analisi si avranno informazioni sulla conservazione delle funzioni di queste proteine durante l’evoluzione degli animali e dei vegetali.
Prove di germinazione in vitro del polline wt e mutanti ubpy saranno seguite da esperimenti di endocitosi in vitro per studiare eventuali alterazioni nel sorting endosomale verso i vacuoli usando sia microscopia confocale che microscopia elettronica (Moscatelli).
Varshavsky 2005 (1), Zheng et al 2006 (2), Katzmann et al.2002 (3), Ang et al., 2004 (4)
Gruenberg and Stenmark 2004 (5), Thien and Langdon 2001(6), Amerik and Hochstrasser 2004 (7), Mizuno et al. 2006 (8), Doelling et al. 2007 (9).