Ottimizzazione della flow chart diagnostica di pazienti con Sindrome di Cornelia De Lange e ricerca di nuovi geni causativi

La Sindrome di Cornelia De Lange (CdLS, OMIM #122470, #300590, #610759) è una rara patologia caratterizzata da dimorfismi craniofacciali, ritardo di crescita e cognitivo, malformazioni degli arti superiori e una varietà di altre anomalie a carico di diversi organi e sistemi. CdLS è geneticamente eterogenea e ad oggi tre geni causativi sono stati identificati, tutti implicati nella coesione dei cromatidi fratelli. Circa il 50% dei pazienti hanno mutazioni del gene NIPBL, che appartiene alla famiglia delle aderine coinvolte nei processi di coesione cromatidica, nella regolazione dell'espressione genica e nella riparazione del DNA. Recentemente il nostro gruppo ha identificato un secondo gene, SMC1, che codifica una subunità del complesso coesinico, le cui mutazioni sono osservate nel 5% dei pazienti. Un terzo gene, SMC3, anch'esso codificante una subunità del complesso coesinico, è risultato mutato in un paziente CdLS. Da anni siamo impegnati nella flow chart diagnostico-molecolare di pazienti CdLS reclutati e inquadrati clinicamente presso la Clinica Pediatrica De Marchi e attualmente >100 pazienti sono risultati mutati in NIPBL o SMC1, permettendoci di stabilire correlazioni tra il gene implicato, il tipo di mutazione e la presentazione clinica predittive del percorso ottimale per il test genetico. Ci proponiamo di applicare alla frazione di pazienti CdLS, negativi ai geni responsabili noti (attualmente >60, ma destinati ad aumentare in parallelo allo screening di nuovi pazienti) due approcci atti ad identificare geni nuovi che giustifichino il rimanente 45% dei pazienti CdlS. Il primo approccio consiste nell' Ibridazione Genomica Comparativa su array (a-CGH), una tecnologia che permette di identificare alterazioni (acquisti e perdite) del numero di sequenze geniche lungo tutto il genoma in un DNA 'test' ibridato insieme ad un DNA reference su una collezione (array) di cloni od oligonucleotidi rappresentativi dell¿intero genoma. Regioni genomiche delete o duplicate emergenti dallo screening (piattaforma Agilent 44K) sono candidate a contenere geni con alterazioni potenzialmente causative di CdlS. Regioni genomiche sufficientemente piccole e ricorrenti verranno sottoposte alla ricerca di candidati 'posizionali', integrando il clonaggio in silico mediante l'Human Genome Browser che fornisce l'elenco sempre piu' rifinito delle sequenze di tutto il genoma a tecniche di screening di mutazione per i geni selezionati. Il secondo approccio prevede di utilizzare i pazienti negativi come piattaforma per la ricerca di nuovi geni CdLS, testando candidati 'funzionali',quali i geni PDS5A e PDS5B, che regolano il caricamento delle coesine sui cromosomi. L'analisi dei suddetti geni verrà effettuata mediante DHPLC (denaturing high-performance liquid chromatography) su apparecchiatura Transgenomic, seguito da sequenziamento diretto dei casi con cromatogrammi abnormi.