IL FATTORE DI CRESCITA EPATICO (HGF) INIBISCE L'INVASIVITA` DI MDA-MB231, CELLULE METASTATICHE DI CARCINOMA MAMMARIO UMANO, COINVOLGENDO MECCANISMI EPIGENETICI

PRESUPPOSTI: Il processo metastatico inizia con la transizione epiteliale-mesenchimale delle cellule di carcinoma. HGF, fattore del microambiente tumorale, potrebbe (i) modificare nelle cellule metastatiche MDA-MB231 il movimento di tipo mesenchimale costitutivo-intrinseco, correlato ad elevata attivita` proteolitica, e (ii) coinvolgere meccanismi epigenetici. Scopo- Valutare come gli istone deacetilasi (HDAC), importanti nel controllo epigenetico della espressione genica tumorale, possano influenzare il fenotipo invasivo-metastatico in risposta ad HGF. Gli HDAC sono target per la terapia antineoplastica: noi usiamo Tricostatina A (TSA), un inibitore di HDAC in fase di studio preclinico, e consideriamo le modificazioni molecolari, a carico di geni e di fattori trascrizionali, possibilmente coinvolte nel movimento invasivo e in quello chemotattico verso la chemochina CXCL12, ligando del recettore CXCR4 su carcinoma mammario. DESCRIZIONE: In cellule di carcinoma mammario ad alta invasivita` MDA-MB231, paragonate alle MCF-7 a bassa invasivita`, studieremo il movimento attraverso filtri ricoperti di Matrigel (BD-Biocoat). Le cellule sono pretrattate con HGF ricombinante umano, aggiungendo TSA per chiarire il ruolo degli HDAC: si esamina, quindi, la migrazione in presenza o assenza di CXCL12. Questo per valutare quanto il movimento delle cellule metastatiche sia influenzato da HGF e la quota dipendente dalla interazione CXCL12/CXCR4. Nelle stesse condizioni sperimentali (HGF±TSA) esaminiamo (a) espressione di CXCR4, utilizzando CXCR4(-2632/+86)Luc;(b)livello proteico di Met, recettore di HGF, di c-Src, Akt, ERK1/2 e JNK, ed il loro stato fosforilativo, di metalloproteasi e uPA;(c)attivita` di NF-kB, AP1 e SP1, che regolano CXCR4 e Met;(d)coinvolgimento di Met nei segnali di movimento, dopo knock-down con siRNA. Le tecniche utilizzate sono:(a)transfezione transitoria del gene reporter;(b)Western blot;(c) gel-shift;(d)transfezione di siRNA. Una possibile differenza nella risposta ad HGF nelle due linee cellulari potrebbe dipendere dalle vie di segnale attivate e dal ruolo degli HDAC. OBIETTIVO: Le cellule metastatiche hanno strategie di compensazione per mantenere il movimento, anche dopo terapia antiproteolitica. Intendiamo evidenziare se HGF possa influenzare il movimento mesenchimale costitutivo delle cellule MDA-MB231 e quello dipendente da interazione CXCL12/CXCR4, tramite modificazioni dirette e/o indirette della espressione genica (CXCR4, Met, componenti di vie di segnale) da parte degli HDAC. CXCL12, prodotto nei siti preferenziali (linfonodi, osso) di disseminazione metastatica, attrarrebbe le cellule di carcinoma mammario; eventuale riduzione della motilita` delle cellule metastatiche da parte di HGF, pure prodotto nel sito secondario, favorirebbe il loro homing. Per interesse applicativo nella terapia antimetastatica, con individuazione di target molecolari, lo studio verra` esteso anche a sistemi 3D(3 dimensioni) e in vivo.