Notch appartiene ad un pathway che gioca un ruolo critico nella determinazione del destino cellulare e, in particolare, nel sistema emopoietico contribuisce a mantenere i progenitori eritroidi in uno stadio indifferenziato e fisiologicamente viene modulato negativamente per ottenere la maturazione degli eritrociti. Notch ha inoltre un ruolo antiapoptotico agendo sia a livello di cellule staminali che di progenitori commissionati
Il progetto è indirizzato allo studio del ruolo del pathway di Notch nella regolazione dell'eritropoiesi. Obbiettivo principale è lo studio d'espressione dei geni Notch e dei geni correlati durante il differenziamento eritroide in due modelli differenti: una cultura a lungo termine di progenitori eritroidi da fegato fetale murino ¿ex vivo¿ e cellule murine EML provenienti da midollo osseo in rappresentanza dell'ematopoiesi adulta. monitorato seguendo l'espressione di marcatori eritroidi precoci (c-Kit) e di marcatori più tardivi (TER119).
Il ruolo di Notch1 nell'ematopoiesi fetale e il suo possibile coinvolgimento nello "switch"fetale-adulto dell'emoglobina, sarà studiato mediante una cultura a lungo termine di progenitori eritroidi di fegato fetale L'analisi sarà focalizzata durante il cambiamento emoglobinico embrionico-adulto. Isoleremo, mediante cell sorter, diverse popolazioni corrispondenti a diversi stadi di maturazione eritroide sulla base della loro espressione degli antigeni di c-Kit e TER119.
In particolare isoleremo le tre seguenti popolazioni:
- Cellule cKit+/TER119- progenitori ematopoietici pluripotenti; - Cellule cKit+/TER119+ corrispondenti a progenitori eritroidi precoci "committed"; - Cellule cKit-/TER119++ corrispondenti ad eritroblasti maggiormente differenziati ed eritrociti maturi
Il ruolo di Notch1 nell'eritropoiesi adulta sarà studiata nella linea cellulare murina EML. Le EML sono cellule midollari multipotenti, dipendenti per la crescita da SCF, immortalizzate mediante l'inserzione di un retrovirus contenente un gene dominante negativo per il recettore dell'acido retinoico (RAR-alpha-403). Le cellule, indottie a differenziare mediante trattamento con gli opportuni agenti, saranno analizzati a diversi stadi di differenziamento sulla base dell'espressione del marker precoce c-Kit o dell'antigene più tardivo TER119; le diverse popolazioni saranno isolate mediante cell sorter.
L'analisi dell'espressione durante il differenziamento, sarà effettuata per Real-time PCR; saranno presi in considerazione:1- geni appartenenti alla via di Notch come i recettori, i ligandi, gli effettori a valle(es. membri delle famiglie di HES ed HERP), i modulatori del pathway (es. la famiglia genica Fringe, Deltex, Numb, ect.).2- Geni coinvolti in modo specifico nella regolazione del differenziamento eritroide o dell'ematopoiesi precoce quali GATA-1, GATA-2, NF-2E, ELKF, SCL, PU.1, EpoR, c-Kit, Runx1, BMP-4, Lmo-2 e 3; e 3- geni eritroidi specifici come quelli per le globine.