Monitoraggio mediante Real Time-PCR di markers della risposta infiammatoria in sangue periferico di cani affetti da filariosi cardiopolmonare in seguito a trattamento farmacologico con ivermectina e doxiciclina.

Il nematode filaride Dirofilaria immitis è un parassita sia dell'uomo che degli animali e in particolare del cane e del gatto nei quali causa una patologia che prende il nome di filariosi cardiopolmonare. Il parassita è in grado di evadere la risposta immunitaria dell'ospite promuovendo il suo sviluppo e la sua sopravvivenza nella sede definitiva dove si riproduce liberando nel torrente circolatorio le microfilarie che, dopo il pasto di sangue di un insetto vettore, potranno infestare altri cani. D. immitis ospita il batterio intracellulare Wolbachia appartenente alla famiglia delle Rickettsiacee; Wolbachia è presente all'interno delle cellule delle corde laterali sia dei maschi che delle femmine e nell'apparato riproduttore delle femmine ed è indispensabile per l'attività metabolica e riproduttiva del parassita. La somministrazione di un farmaco microfilaricida (ivermectina) influenza il delicato equilibrio ospite/parassita modificando il processo infiammatorio nell'ospite. In particolare in pazienti affetti da Onchocerca volvulus cellule del sangue che normalmente non rispondono agli antigeni del parassita, dopo il trattamento con ivermectina cominciano a produrre, in vitro, citochine di tipo Th1 e Th2 come dimostrato in saggi ELISA e in seguito a monitoraggio di espressione genica. Lo scopo di questo progetto è quello di valutare se e come vari, in vivo, l'espressione di TNFalpha, IL10 e IL8 in cani infestati con D. immitis durante il trattamento con ivermectina, doxiciclina (un antibiotico che agisce sul batterio Wolbachia) e con i due farmaci contemporaneamente. I cani saranno quindi divisi in gruppi in base al trattamento che verrà loro effettuato (ivermectina, doxiciclina, ivermectina+doxiciclina); alcuni cani non verranno invece trattati e andranno a costituire il gruppo di controllo. L'RNA totale verrà estratto mediante l'utilizzo di un kit commerciale e retrotrascritto a cDNA a partire dal sangue periferico prelevato da ciascun cane durante i trattamenti e conservato con uno stabilizzatore per l'RNA. L'espressione relativa delle citochine verrà valutata mediante PCR quantitativa (Real Time-PCR) mettendo a punto un sistema di rilevazione tramite SYBR-Green. La quantificazione relativa è resa possibile tramite confronto dell'espressione dei targets in esame nei diversi campioni operata mediante il calcolo del delta-delta Ct, dopo normalizzazione dei relativi cDNA con gene housekeeping, ossia un gene la cui espressione in un dato tipo cellulare o tessuto viene ritenuta stabile ed indipendente dalle condizioni sperimentali. I risultati di espressione relativa dei target per ciascun cane verranno analizzati con test statistici per valutare se il profilo di espressione dei singoli target varia in maniera significativa tra i differenti gruppi di trattamento e il gruppo di controllo.