Studio della infezione da virus dell'epatite C nelle cellule polimorfonucleate del sangue in pazienti con infezione cronica sottoposti a terapia antivirale

L¿infezione da virus dell¿epatite C rappresenta un problema sanitario di rilevanza mondiale, e interessa circa il 2% della popolazione italiana. Rappresenta inoltre la principale causa di scompenso epatico, carcinoma epatocellulare ed indicazione al trapianto di fegato. La terapia antivirale è in grado di ridurre il rischio di sviluppare complicanze dell¿epatite C in caso di eliminazione persistente del virus a livello ematico (Risposta virologica sostenuta, SVR). Il più forte predittore di successo terapeutico è oggi ritenuto essere la negativizzazione di HCV-RNA alla quarta settimana di terapia (Risposta virologica rapida, RVR), poiché si associa a probabilità di guarigione del 80-85%. Nella pratica clinica il valore predittivo di questo endpoint è intorno al 80%, poiché una percentuale di pazienti compresa tra il 20-30% di coloro che ottengono la RVR va incontro a recidiva post-trattamento (Relapse). Ad oggi non è noto l¿esatto meccanismo sottostante tale evento, un¿ipotesi potrebbe essere la persistenza di HCV-RNA nei cosiddetti santuari extraepatici, tra cui i polimorfonucleati, anche se non esistono sufficienti evidenze scientifiche a supporto. Scopo del nostro progetto sarà di identificare l¿eventuale presenza di sequenze virali di HCV nei linfociti periferici alla quarta settimana di terapia, quantificare la carica virale e di correlarla con la carica virale sierica e l¿outcome terapeutico. Lo studio verrà condotto su 100 pazienti consecutivi con infezione cronica HCV, mai precedentemente trattati con farmaci antivirali e arruolati presso il centro A.M. e A. Migliavacca dell¿Università di Milano. Le cellule PBMC verranno isolate mediante centrifugazione per 30 minuti a 1200 g dopo stratificazione su Ficoll-Hypaque di 20 ml di sangue in EDTA ottenuto pre-terapia e alla quarta settimana di terapia. Dopo lavaggi ripetuti le cellule saranno risospese in PBS per il conteggio al microscopio e risospese in RPMI per ottenere la stimolazione mitogena in presenza di PHA e antibiotici per 72 ore. La determinazione dell¿HCV-RNA qualitativo prevede estrazione dell'RNA con fenolo-cloroformio, sintesi di cDNA e nested PCR con primers della regione 5¿ NC. Il livello di sensibilità (circa 25 IU/ml) è stato stabilito dal confronto con un pannello di plasmi HCV positivi standardizzato in UI secondo il 1° Standard Internazionale per HCV-RNA (WHO). La quantificazione dell¿HCV-RNA è basata sulla tecnologia real-time PCR con metodo Cobas Taq Man e prevede estrazione dell¿RNA, sintesi di cDNA, amplificazione mediante PCR. Uno standard di quantificazione è incorporato in ogni campione, con un numero di copie noto. Il titolo di HCV-RNA viene calcolato comparando il segnale dei campioni a quello dello standard. Il limite di sensibilità è 25 UI/ml.