Ruolo della alfa-L-fucosidasi dello spermatozoo nella fecondazione in Drosophila e in Ceratitis

PRESUPPOSTI. Le basi molecolari del riconoscimento uovo/spermatozoo negli insetti non sono noti. Ciò ha un impatto negativo sullo sviluppo di strategie mirate al controllo della riproduzione di insetti nocivi dal punto di vista sanitario ed agro-economico. La mancanza di informazioni è dovuta soprattutto al fatto che i gameti degli insetti non si prestano alle consuete metodiche di fertilizzazione in vitro utilizzate per altri organismi. In precedenza, noi abbiamo dimostrato la presenza nella membrana plasmatica dello spermatozoo di numerose specie di Drosophila di una alfa-L-fucosidasi biochimicamente simile a quelle che in altri organismi modello (ascidie e mammiferi) mediano le interazioni iniziali tra spermatozoo e cellula uovo (1,3). Nel corso di tali interazioni l'enzima, agendo in condizioni non catalitiche, riconosce e lega un glicoconiugato della superficie dell¿oocita contenente il carboidrato specifico per l'enzima stesso. Abbiamo identificato il gene che codifica per alpha-L-fucosidasi (3) e ne abbiamo studiato l'espressione. Inoltre, una analisi bionformatica ha indicato che tale enzima presenta 43% di identità con l'omologo di mammiferi (topo e uomo) e di ascidia, e 46-51% di identità con le proteine omologhe degli insetti in cui il gene codificante è stato individuato (Apis e Anopheles) (2). Abbiamo inoltre individuato la presenza di alpha-L-fucosidasi simile a quelle dello spermatozoo di Drosophila anche nello spermatozoo di Ceratitis capitata, un dittero infestante di molte piantagioni fruttifere e di elevato interesse economico. OBIETTIVO. Ci proponiamo di sviluppare di un test in vitro per lo studio dell'interazione tra alfa-L-fucosidasi di membrana dello spermatozoo e la superficie della cellula uovo utilizzando Drosophila e Ceratitis come modelli. Questo test rappresenterà un metodo alternativo ai test in vitro che utilizzano cellule isolate e che sono generalmente impiegati per l'analisi di molecole responsabili del binding uovo/spermatozoo in mammiferi e in molti invertebrati. I risultati potranno avere una ricaduta applicativa nell'ambito di strategie volte al controllo della riproduzione di altri insetti rilevanti dal punto di vista sanitario o economico. DESCRIZIONE. La alfa-L-fucosidasi dello spermatozoo verrà purificata con le procedure da noi messe a punto in precedenza (3)e biotinilata. In essa verrano incubati gli oociti maturi in condizioni sperimentali che dovranno essere determinate. Il binding e la distribuzione spaziale della proteina dello spermatozoo sugli involucri della cellula uovo verranno studiati in microscopia in fluorescenza dopo ulteriore incubazione degli oociti in streptavidina coniugata a fluorocromi. La natura del ligando fucosilato dell'enzima verrà determinata con saggi di affinità in fase solida per glicoproteine naturali e neoglicoproteine contenenti fucosio in diverse configurazione stereochimiche, e con test di inibizione del binding dell'enzima alla cellula uovo.