Sviluppo di inibitori del ripiegamento tridimensionale della proteasi di HIV come farmaci potenziali per la cura dell'AIDS.

Presupposti. Tutti i farmaci attualmente disponibili per il trattamento dei soggetti infettati da HIV selezionano varianti virali resistenti. Ciò si verifica a causa della scarsa fedeltà della trascrittasi inversa di HIV, che introduce mutazioni nel genoma virale con frequenze molto elevate. Generalmente, il sito d'interazione dei farmaci sugli enzimi bersaglio può subire modificazioni senza che queste riducano significativamente la funzione dell'enzima nel processo di infezione. Se il bersaglio molecolare fosse invece una regione essenziale per il corretto ripiegamento dell'enzima, sarebbe in linea di principio molto più difficile l'insorgenza di mutanti resistenti: questi dovrebbero infatti essere alterati nella regione responsabile dell¿assunzione di una corretta conformazione tridimensionale, una situazione incompatibile con la funzionalità dell'enzima bersaglio. La proteasi di HIV assume la sua conformazione tridimensionale a partire da una struttura locale elementare (LES) che è stata precisamente mappata (1). Descrizione ed Obiettivi. Intendiamo utilizzare peptidi sintetici in grado di interferire con la LES della proteasi di HIV su cellule cronicamente infettate, allo scopo di verificare la capacità di queste molecole di inibire l'attività dell'enzima anche in un sistema cellulare, per estendere le osservazioni fatte dagli autori citati in un sistema interamente in soluzione. L'eventuale inibizione verrà messa in evidenza, in seguito all'esposizione delle cellule a queste molecole, mediante una valutazione della capacità dell'enzima di convertire il suo substrato naturale (la Pr55 codificata dal gene gag) nella proteina strutturale matura p24 di HIV, processo che è essenziale per la produzione di particelle virali infettanti. Ciò verrà effettuato mediante la valutazione qualitativa e quantitativa sia del precursore Pr55, sia della proteina matura p24, mediante western blot seguito da densitometria, grazie all'uso di anticorpi monoclonali specifici per queste due molecole. Una volta ottimizzati i parametri e le condizioni di utilizzazione (dosi, solventi, tempi) su cellule della linea cronicamente infettata da HIV (H9/HTLV-IIIb), verranno effettuati studi su isolati virali utilizzati in infezioni acute di leucociti periferici umani. Ciò permetterà di valutare la futura trasferibilità alla clinica, di verificare l'efficacia degli inibitori anche su ceppi virali già resistenti ad altri inibitori della proteasi e di altri enzimi di HIV, ed infine di verificare, in coltivazioni a lungo termine in presenza continua degli inibitori, l'eventuale insorgenza di varianti resistenti. 1) Broglia RA, Tiana G, Sutto L, Provasi D, Simona F. Design of HIV-1-PR inhibitors that do not create resistance: blocking the folding of single monomers. Protein Sci. 2005;14(10):2668-2681.