Interazione tra le proteine del locus UL131-UL128 e le proteine fusogene virali nella penetrazione del citomegalovirus umano nella cellula bersaglio

II citomegalovirus umano (HCMV), uno dei maggiori opportunisti negli stati di incompetenza immunitaria, infetta diversi tipi cellulari, tra cui cellule endoteliali, che sono un sito di proliferazione e disseminazione virale. Infetta inoltre monociti, cellule dendritiche e cellule epiteliali (retiniche, polmonari, delle ghiandole salivari e delle mucose gastrointestinali). I tre geni contigui UL131-128 sono stati da noi caratterizzati come determinanti essenziali del tropismo di HCMV per le cellule endoteliali. pUL130 e pUL128 sono componenti del virione associate al complesso di fusione virale gH-gL, e sembrano cooperare con l'altra proteina fusogena di HCMV, gB, nell'ingresso nella cellula. Come sviluppo logico del lavoro già svolto, l'unità tenterà di confermare e corroborare ulteriormente il modello di fusione che lega le proteine UL131-UL128, gH e gB. I risultati attesi sono potenzialmente rilevanti, sia per lo sviluppo di vaccini anti-HCMV, sia per il disegno razionale di molecole antivirali che interferiscano con il legame di HCMV a recettori e/o con la fusione. Obiettivi Specifici Come primo obiettivo di questo progetto, versioni wt o mutate dei geni UL131-UL128 verranno espresse in cellule umane, insieme a forme transmembranarie o secrete dell'eterodimero gH-gL a cui si assemblano, per tentare di definire i determinanti delle proteine UL131-UL128 essenziali per la formazione del complesso. In particolare, questo approccio mira a chiarire il ruolo della proteina UL131 nell'assemblaggio e nell'esportazione del complesso. L'analisi per spettrometria di massa del complesso purificato, preceduta o meno da crosslinking chimico, sarà usata per tracciare una mappa di interazioni proteina-proteina del complesso. Un secondo obiettivo mira a supportare, usando due sistemi sperimentali innovativi, il modello di fusione che include un'interazione fra complesso gH e gB innescata dalle proteine UL131-UL128. Verrà impiegato un saggio di fusione cellula-cellula capace di distinguere eventi di emifusione fra membrane da una fusione completa. Questo saggio è potenzialmente in grado di confermare che le proteine UL131-UL128 sono necessarie per iniziare la fusione, e di chiarire se gB sia strettamente richiesta solo per completare la fusione (come proposto recentemente per la proteina omologa di HSV-1), o se partecipi allo stadio di emifusione (come suggerito dai nostri risultati). In parallelo, un metodo genetico, fondato sul concetto della split ubiquitin, verrà usato per monitorare l'interazione gB-gH in cellule intatte.